DB34∕T 3305-2018 石榴干腐病检测与鉴定技术规程.pdf

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1、ICS65.020.20B16DB34安徽省地方标准DB34/T3305—2018石榴干腐病检测与鉴定技术规程DetectionandIdentificationofPilidiellagranati文稿版次选择2018-12-29发布2019-01-29实施安徽省市场监督管理局发布DB34/T3305—2018前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由安徽省农业科学院植物保护与农产品质量安全研究所提出。本标准由安徽省动植物检验检疫标准化技术委员会归口。本标准主要起草单位：安徽省农业科学院植物保护与农产品质量安全研究所，安徽省农业科学院园艺研究所，淮北市农业委

2、员会，怀远县淮西石榴研究所，怀远县园艺站。本标准主要起草人：杨雪、徐义流、陈雨、秦改花、朱军、谷春艳、张爱芳、臧昊昱、高同春、戚仁德、刘长华、娄志。IDB34/T3305—2018石榴干腐病检测与鉴定技术规程1范围本标准规定了石榴干腐病（pomegranatedryrot）的检测与鉴定技术。本标准适用于石榴的枝干、果实中石榴干腐病病菌的检测和鉴定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3石榴干腐病的症状

3、与病原菌病原菌：石榴壳座月孢（Pilidiellagranati）分类地位：属真菌界Fungi，子囊菌门Ascomycota，子囊菌纲Sordariomycetes，间座壳目Diaporthales，黑盘孢科Melanconidaceae，壳座月孢属Pilidiella。其他信息参见附录A。4方法原理本方法以PCR鉴定和致病性鉴定为主要判定依据，石榴干腐病菌的形态特征作为辅助鉴定依据。5仪器设备5.1高速离心机：转速≤15000r/min5.2涡旋振荡器5.3PCR仪5.4高压灭菌锅5.5恒温培养箱：20℃～30℃5.6冰箱：4℃、-20℃、-70℃5.7恒温水浴锅：4℃～100

4、℃5.8电泳仪5.9凝胶成像仪5.10可调移液器：1-10μL，10μL-100μL，100μL-1000μL5.11天平：精度0.001g5.12纯水仪5.13超净工作台1DB34/T3305—20185.14显微镜：物镜头10×～40×6试剂和培养基6.1PCR试剂：2×PCRTaqMasterMix6.2凝胶电泳试剂：琼脂糖、TAE电泳缓冲液（Tris4.84g，Na2EDTA·2H200.75g，冰乙酸1.142mL，蒸馏水1000mL，pH8.5）6.3DNA提取试剂：CTAB提取液（Tris-HCl(pH8.0)100mmol/L，EDTA20mmol/L，NaCl1

5、.4mol/L，CTAB2％(w/v)，蒸馏水1000mL，巯基乙醇(用时加入)40mmol/L），无水乙醇，10％SDS，酚/氯仿/异戊醇（25：24：1），氯仿，异丙醇，TE（Tris-HCL10mmol/L，EDTA1mmol/L，pH8.0）6.4培养基：WA培养基（琼脂粉20g，水1000mL）、PDA培养基（去皮马铃薯200g，葡萄糖20g，水1000mL，琼脂粉20g）6.5除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂，实验用水符合GB/T6682中三级水的标准。7实验室鉴定7.1病原菌分离与纯化将石榴病果用75％乙醇表面消毒后，用无菌水清洗1次，于病健交界处取少量组

6、织置于WA培养基中培养。待长出菌丝后，转至PDA培养基平板上，28℃恒温培养，并观察培养性状（参见附录A.2）和孢子形态（参见附录A.3）。进行单孢分离与纯化后，用于PCR鉴定。7.2PCR鉴定7.2.1病原菌DNA提取从培养好的菌落边缘用打孔器取10块直径为5mm的菌碟，转至PDA液体培养基，28℃振荡培养5d，过滤收集菌丝，经液氮冷冻研磨成粉，加入900μL2％CTAB提取液和90μL10％SDS，涡旋混匀，于60℃水浴1h，期间每隔10min上下颠倒几次，常温条件下12000rpm离心10min；取上清，加入等体积酚/氯仿/异戊醇（25：24：1），颠倒混匀，常温条件下12

7、000rpm离心5min；将上清转移至新的EP管中，加入等体积氯仿，轻轻颠倒混匀，常温条件下12000rpm离心5min；上清转移至新EP管中，加入1倍于上清体积的异丙醇，-20℃条件沉淀15min；常温条件下12000rpm离心5min，倾去上清，沉淀用70％乙醇洗涤2次，37℃条件下待乙醇挥发干；加适量灭菌超纯水或者TE（pH8.0）溶解沉淀（含20μg/mlRNase），37℃消解30min后电泳检测，-20℃保存备用。7.2.2PCR引物利用GenBank通过序列分析比较