微生物学实验报告——双歧杆菌分离.pdf

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1、微生物学实验报告——双歧杆菌的分离纯化微生物学实验报告乳酸菌分离纯化——双歧杆菌的分离纯化2012/6/5实验目的：从酸奶等富含乳酸菌的物质中分离到具实验材料：蒙牛冠益乳（含bb-12双歧杆菌），伊利有活性的双歧杆菌并进行初步鉴定。酸牛奶（ABLS益生菌），佳宝、光明原味酸牛奶，实验原理：双歧杆菌是动物体肠道内的正常优势生双歧杆菌乳酸菌三联活菌片（含长型双歧杆菌理细菌，革兰氏阳性，无芽孢，没有运动能力，最Bifidobacteriumlongum），枯草芽孢杆菌（Bacillus适生长温度37℃

2、~41℃，专性厌氧。双歧杆菌的细胞subtilis）呈现多样形态，有短杆较规则形、纤细杆状具有尖实验方法：细末端形、球形、长杆弯曲形、分枝或分叉形、棍1.培养基棒状或匙形。单个或链状、V形、栅栏状排列，或聚双歧杆菌琼脂培养基【蛋白胨（鱼粉）10.0g，牛肝集成星状。双歧杆菌的菌落光滑、凸圆、边缘完整、浸粉5.0g，牛肉膏3.0g，酵母浸粉5.0g，胰蛋白胨乳脂至白色、闪光并具有柔软的质地(7)。8.0g，可溶性淀粉0.5g，磷酸氢二钾1.0g，磷酸二氢因为双歧杆菌是严格厌氧细菌，所以双歧杆菌钾1

3、.0g，葡萄糖10.0g，乳糖3.0g，L-半胱氨酸0.5g，的培养条件必须无氧，且培养基要具有低氧化还原琼脂15g，吐温801g，溶液A（FeSO4·7H2O0.2g，电势。培养双歧杆菌最常用的方法是亨盖特厌氧滚MgSO4·7H2O4.0g，MnSO4·4H2O0.135g，NaCl0.2g管法(1,5,7)，此外还有厌氧箱法，厌氧袋法和厌氧于100ml蒸馏水定容）10ml，蒸馏水定容至1L】罐法等。亨盖特厌氧滚管法是亨盖特（Hungate）于枯草芽孢杆菌LB琼脂培养基【胰蛋白胨10g/L，酵

4、1950年发展起来的一套严格厌氧微生物的培养技术，母浸粉5g/L，Nacl10g/L，琼脂粉15g/L】主要原理是利用铜柱氧化除氧的滚管分离纯化法。2.简易厌氧罐法亨盖特厌氧滚管法的优点是可以实时检查培养物，将双歧杆菌琼脂培养基倒入培养皿中，待培养基冷无氧效果好且花费不高，但需要专门的仪器和技术却后，先用接种环取LB琼脂培养基上生长的枯草芽性很强的操作。本实验采用的简易厌氧罐法是一种孢杆菌菌落接种在培养皿一侧，再于另一侧划线接操作简单且成本很低的方法，主要原理是利用焦性种酸奶或三联活菌片的稀释液

5、，按照每L容积1.0g没食子酸除去厌氧罐内的氧气。该方法的缺点是焦焦性没食子酸、10%NaOH溶液10ml加入厌氧罐后，性没食子酸与NaOH反应过程中会产生一定量的立即以凡士林和胶带密封，置于37℃恒温培养2-3NO，可能不利于细菌的生长；此外，过量的NaOH天。会将厌氧罐中的CO2一起除掉，而CO2对多数厌氧菌的生长有促进作用。另外，在同一个培养皿上接种好氧细菌（如大肠杆菌和枯草杆菌）能加强除氧的效果。本实验所用的培养基参考了NPNL培养基(6)和BS培养基的配方，其中鱼粉、牛肉膏、酵母浸粉、

6、胰蛋白胨的作用是提供氮源、维生素和生长因子，葡萄糖和乳糖为乳酸菌发酵提供糖类底物，磷酸氢二钾和磷酸二氢钾为酸碱缓冲剂，硫酸亚铁、硫酸锰为乳酸菌提供生长因子，氯化钠维持均衡的渗透压。如果在培养基中加入一定浓度的抗生素，比如硫酸卡那霉素（75μg/ml）、硫酸新霉素（30-200μg/ml）、硫酸巴龙霉素（20-200μg/ml）、萘啶酮酸（15或80μg/ml）、氧化锂（3mg/ml）、丙酸钠（10或15g/L）、山梨酸（0.4g/L）等，培养基就成为双歧杆菌的选择图1.实验中使用的简易厌氧罐性培

7、养基(7)。1微生物学实验报告——双歧杆菌的分离纯化实验结果：以双歧杆菌乳酸菌三联活菌片为菌源，找合适菌源，首次成功得到双歧杆菌单菌落已是第在厌氧罐中经过72h恒温培养得到了以双歧杆菌为三周），最终没有获得双歧杆菌的纯培养和相关生化主的单菌落。因为双歧杆菌暴露在空气中短时间内指标。但仅从形态学特征(3)可以判断，该实验方法即大量死亡，划线分离方法会使双歧杆菌活性大大已经分离得到双歧杆菌（Bifidoubacteriumsp.）。所以降低，加之时间所限（由于需要摸索实验条件，寻本实验仅就双歧杆菌的

8、形态学特征进行观察总结。图2.培养72h后的双歧杆菌分离培养基。左侧接种枯草杆菌，几乎没有形成明显的菌落；右侧接种三联活菌片稀释液，有大小不等乳白色半透明光滑圆形菌落，偏小的菌落多为双歧杆菌菌落。图3.双歧杆菌革兰氏染色照片（1000×），显示双歧杆菌具有多种特殊形态。此外，视野中有细杆形杂菌。2微生物学实验报告——双歧杆菌的分离纯化cabd图4.局部放大后观察到的双歧杆菌形态。可以看到双歧杆菌具有分支形态和末端膨大形态，分支长度和角度因个体而异，没有明显的一致性，末端膨大处最大直径约1μm。图