【实验】测定土壤中微生物的数量.pptx

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1、课题2土壤中分解尿素的细菌的分离与计数尿素是一种高浓度氮肥，属中性速效肥料，也可用于生产多种复合肥料。在土壤中不残留任何有害物质，长期施用没有不良影响。尿素经过土壤中细菌的脲酶作用，分解成氨后，才能被作物吸收利用。因此，尿素要在作物的需肥期前4～8天施用。尿素分子的立体结构CO(NH2)2+H2OCO2+2NH3脲酶两个主要目的：（1）从土壤中分离出能够分解尿素的细菌；（2）统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌。研究思路美国黄石国家公园的一个热泉（一）筛选菌株美国微生物学科布鲁克1966年发现耐热细菌，从水生耐热细菌Taq得到耐高温的TaqDNA聚

2、合酶。一、研究思路(一)筛选菌种1实例：耐高温的DNA聚合酶启示：PCR技术：要求使用耐高温（930C）的DNA聚合酶。寻找目的菌种时要根据它对_______________，到相应的环境中去寻找。生存环境的要求耐高温的酶耐高温生物体高温环境（热泉、火山口）寻找寻找Taq细菌筛选原因:因为热泉的高温条件淘汰了绝大多数微生物，使耐热的Taq细菌保留下来。2实验室中微生物的筛选原理人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物生长。思考：该培养基的配方中，为微生物的生长提供碳源和氮源的分别是什么物质？碳源：葡萄糖、尿素

3、氮源：尿素此配方能否筛选出产生脲酶的细菌？为什么？配方以“尿素为唯一氮源”，只有产生脲酶的细菌才能利用尿素作为氮源而生存。3选择培养基：在微生物学中，将允许______________________，同时_________________________生长的培养基。特定种类的微生物生长抑制或阻止其他种类微生物结果：培养一定时间后，该菌数量上升，再通过稀释涂布平板等方法对它进行纯化培养分离。如何对细菌进行计数？1显微镜直接计数：利用血球计数板(血细胞计数板），在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。没有染色时，死的和活的菌体都能统计，实验结果偏大

4、。2稀释涂布平板法（间接计数）101102103104105106稀释涂布平板法运用稀释涂布平板法来统计样品中的活菌数。原理：统计菌落数目的理论依据：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。因此，恰当的稀释度是成功地统计菌落数目的关键。为了保证结果准确，通常将几个稀释度下的菌液都涂布在平板上。1个活菌→1个菌落稀释涂布平板法运用稀释涂布平板法来统计样品中的活菌数。①选择菌落数在30～300的平板上计数。②需培养计算出三个或三个以上的平板菌落求平均数。注意事项？说明设置重复组的重要性。第一位同学只涂布了一个平板，没

5、有设置重复组，因此结果不具有说服力。第二位同学考虑到设置重复组的问题，涂布了3个平板，但是，其中1个平板的计数结果与另2个相差太远，说明在操作过程中可能出现了错误，因此，不能简单地将3个平板的计数值用来求平均值。这个实例启示学生，在设计实验时，一定要涂布至少3个平板，作为重复组，才能增强实验的说服力与准确性。在分析实验结果时，一定要考虑所设置的重复组的结果是否一致，结果不一致，意味着操作有误，需要重新实验。稀释涂布平板法运用稀释涂布平板法来统计样品中的活菌数。原理：1个活菌→1个菌落①选择菌落数在30～300的平板上计数。②需培养计算出三个或三个以上的

6、平板菌落求平均数。③统计的菌落往往比活菌的实际数目低。注意事项★★★当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。因此结果一般用菌落数而不是用活菌数来表示。（二）统计菌落数目每克样品中的菌株数致＝（C÷V）×MC：某一稀释度下平板上生长的平均菌落数V：涂布平板时所用的稀释液的体积（ml)M：稀释倍数为了测定微生物的数量，接种时应采用______________法，某同学在4个培养基上分别接种稀释倍数为106的土壤样液0.1mL，培养后菌落数分别为180、155、176、129个，则原土壤样液中上述微生物的含量为________________

7、____，测定的活菌数比实际活菌数________(填“低”“高”“基本一致”)。低稀释涂布平板1.6×109个/mL稀释度（倍）106107108平板123123123平板菌落数（个）432421445786774968（1）样品稀释：先将样品稀释10倍，可用无菌移液管吸取25mL酸奶样品加入盛有mL无菌水的三角瓶中，使样品与水充分混匀。然后进行系列稀释操作，得到稀释至106、107、108倍的样品。（2）培养与统计：吸取不同稀释度的样品各1mL，分别置于不同培养皿内，加入适宜温度的溶化状态的培养基，使之混合均匀，冷却成平板。每个稀释度做3个重复。在

8、适宜条件下培养一段时间后，对平板的菌落数进行统计，结果如下：涂布时应当在附近操作，为了保证结果