微生物基本操作规范(4)接种、分离纯化.ppt

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1、主要内容：§1清洗、消毒和灭菌操作§2培养基的制备§3采样和取、制样§4接种、分离纯化§5制片、染色及显微观察§6实验室安全基础知识§4接种、分离纯化4.1接种将微生物接到适于它生长繁殖的人工培养基上或活的生物体内的过程叫做接种。4.1.1接种工具1．接种针2.接种环3.接种钩4.5.玻璃涂棒6.接种圈7.接种锄8.小解剖刀图4-1接种和分离工具4.1.2无菌操作培养基经高压灭菌后，用经过灭菌的工具（如接种针和吸管等）在无菌条件下接种含菌材料（如样品、菌苔或菌悬液等）于培养基上，这个过程叫做无菌接种操作。在实验室检验中的各种接种必须是无菌操作。接种时，打开培

2、养皿的时间应尽量短。用于接种的器具必须经干热或火焰等灭菌。接种环的火焰灭菌方法：通常接种环在火焰上充分烧红（接种柄，一边转动一边慢慢地来回通过火焰三次），冷却，先接触一下培养基，待接种环冷却到室温后，方可用它来挑取含菌材料或菌体，迅速地接种到新的培养基上。然后，将接种环从柄部至环端逐渐通过火焰灭菌，复原。不要直接烧环，以免残留在接种环上的菌体爆溅而污染空间。平板接种时，通常把平板的面倾斜，把培养皿的盖打开一小部分进行接种。在向培养皿内倒培养基或接种时，试管口或瓶壁外面不要接触底皿边，试管或瓶口应倾斜一下在火焰上通过。4.2接种法与纯培养的分离技术含有一种以上

3、的微生物培养物称为混和培养物（Mixedculture）。如果在一个菌落中所有细胞均来自于一个亲代细胞，那么这个菌落称为纯培养（Pureculture）。在进行菌种鉴定时，所用的微生物一般均要求为纯的培养物。得到纯培养的过程称为分离纯化。4.2.1平板划线分离培养法平板划线分离培养法，用无菌的接种环取培养物少许在平板上进行划线，使培养物中混在的多种细菌在培养基表面分散生长，各自形成菌落，根据菌落的形态及特征，挑选单个菌落，经过移种而获得纯种细菌（纯培养）。分离细菌的方法很多，最常用的是平板划线分离法。根据划线的方式不同有斜线法、曲线法、方格法、放射法、四格法

4、等。（图4-2）图4-2平板划线分离法1.斜线法2.曲线法3.方格法4.放射法5.四格法1.曲线划线分离法1)先将接种环火焰灭菌,待冷后取培养物少许;2)左手拿起平板，以中指为支点，并用拇指和食指将平板盖打开；3)右手迅速将取有培养物的接种环从打开的空间插入平板内，使接种环与培养基表面呈45℃角，在酒精灯上方5~6cm处划线接种。先在平板上1/5处轻轻涂布，然后即可左右来回以曲线形式作连续划线接种，线与线间留有适当距离，将整个平板表面划满曲线；4)注明标识后，置35℃培养箱中培养，一般在18~24小时后观察结果。2.斜线(分区)划线分离法1)用接种环先将培养

5、物涂布于平板1区并作数次划线,再在2、3……区依次划线。2)每划完一个区域，均将接种环灭菌一次，待冷后再划下一区域。3)每一区域的划线均接触上一区域的接种线1~2次，使接种量逐渐减少，以获得单个菌落。4)其他操作与上述曲线划线分离法相同。斜线接种示意图3.方格划线法将培养物涂布于平板上1/5处，接种环经火焰灭菌后，自1/5划线处作平行划线5~6条，将接种环灭菌后，划垂直线5~6条，使呈正方形格。其他操作同前。细菌在固体培养基表面只能在固定的地方生长繁殖，经过一定的培养时间后，可形成肉眼可见的菌落。菌落中只含有一种细菌，而每种细菌的菌落各有其特征。菌落形态往往

6、有助于初步识别细菌；还可以由此获得细菌而进行一系列的鉴定。识别菌落的能力是从事微生物检验人员的极为重要的基本功。菌落形态观察1)大小:以mm表示。菌落的大小随细菌种类、培养基及培养时间等条件而不同。同一种细菌在同一平板上，在密集处的菌落比疏散处小。因此，表示菌落大小时，应注明培养基名称。一般以培养18~24小时后，选散在处的菌落大小。1mm左右为小菌落；2~3mm为中等大；3mm以上为大菌落。2)形状及边缘：圆形、不规则、放射状、树根状、边缘整齐、波形、锯齿状、卷发状等。3)隆起：平的、突起的、凸面的、凸形的等。4)表面：光滑（S型）、粗糙（R型）；有无光泽

7、等。图4-3细菌的培养特征1.点状2.圆形3.丝状4.不规则形5.假根状6.纺锤状7.扁平8.隆起9.凸起10.垫状11.脐状12.边缘整齐13.波状14.裂片状15.啮蚀状16.丝状17.卷发状18.丝线状19.刺毛状20.串珠状21.疏展状22.树根状23.假根状24.丝状25.串珠状26.乳头状27.绒毛状28.树根状29.量杯状30.萝卜状31.漏斗状32.囊状33.层状34.絮状35.环状36.蹼状37.膜状5)构造:均匀、露滴状、颗粒状、发状、皱招状等。6)颜色：无色、白色、灰色、灰白色或乳白色、荧光绿、金黄色、柠檬色、红色等、7)透明度：透明、

8、半透明、不透明、微透明等。8)硬度：硬、软、干燥、湿