[精品]紫外诱变育种方案.doc

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1、紫外诱变大肠杆菌str（链霉素）抗性突变株的筛选一、H的要求1、观察紫外线对链霉索产牛抗性的诱变效应2、学习并掌握物理诱变育种的方法。二、基本原理紫外线的波长在200^380nmZ间，但对诱变最有效的波长仅仅是在253、265nm,一般紫外线杀菌灯所发射的紫外线大约有80%是254nmo紫外线诱变的主要生物学效应是由于DMA变化而造成的，DNA对紫外线有强烈的吸收作用，尤其是碱基屮的U密噪，它比嚓吟更为敏感。紫外线引起DNA结构变化的形式很多，如DNA链的断裂、碱基破坏。但其最主要的作用是使同链DNA的相邻唏噪间形成胸腺唏喘二聚体，阻碍碱基间的正常配对，从而引起微生物突变或死亡。经紫外线

2、损伤的DNA,能被可见光复活，因此，经诱变处理后的微生物菌种要避免长波紫外线和可见光的照射，故经紫外线照射后样品需用黑纸或黑布包裹。另外，照射处理后的泡子悬液不要贮放太久，以免突变在黑暗屮修复。三、实验材料（~）菌种人肠杆菌（二）培养基（完全培养基）1.肉膏蛋白月东培养基牛肉膏0.5g蛋白腺1.0gNad0.5g水100mLpH7.2100KPa、121°C高压蒸汽灭菌20mirio如配制固体培养基需加琼脂1・5%〜2%。如配制半固体培养基则加琼脂0.7%〜0.8%。（三）主要药品牛肉膏、蛋白月东、NaCl.可溶性淀粉、链霉索。(%1)主要器皿试管30支、移液管ImLlO支、5汕3支、1

3、0也1支、锥形瓶10个、量筒、烧杯、培养皿30个、离心管、20W紫外灯、磁力搅拌器、离心机、紫外诱变箱等。四、实验内容(―)诱变1.菌悬液的制备出发菌株移接新鲜斜面培养基，37°C培养16〜24h。取已培养20h的活化大肠杆菌斜面一支，用10mL生理盐水将菌苔洗下，取4mL于5mL离心管屮离心(3000r/min)15niin,弃上清液，将菌体用无菌生理盐水洗涤2次，最后制成菌悬液并倒入盛有玻璃珠的锥形瓶屮，强烈振荡10min,以打碎菌块制成单菌悬液，用血球计数板在显微镜下直接计数。调整细胞浓度为107mLo2.平板制作将肉膏蛋白月东培养基熔化后，冷至45°C左右倒平板。待平板完全冷却后

4、，取0.ImL链霉索用无菌棒涂布于平板上。其屮留三块平板不涂布链霉索作为对照。3.诱变处理(1)预热正式照射前开启紫外灯预热30mine(2)搅拌取制备好的菌悬液5mL移入6cm的无菌培养皿屮，放入无菌磁力搅拌捧，置磁力搅拌器上，20W紫外灯下30cm处。(3)照射然后打开皿盖边搅拌边照射,剂量分别为5s,10s,15so可以累积照射，照射完毕先关上皿盖再关闭搅拌和灯。所有操作必须在红灯下进行。4.稀释涂平板在红灯下分别取未照射的菌悬液(作为对照)和照射过的菌悬液各0.5mL进行适半稀释分离。取最后3个稀释度的稀释液涂于肉膏蛋白豚平板上，每个稀释度涂3个平板，每个平板加稀释液0.1mL,

5、用无菌玻璃刮棒涂匀，37°C培养48h(用黑布包好平板)。注意在每个平板背后要标明处理吋间、稀释度、组别。(%1)计篡存活率及致死率1.存活率将培养48h后的平板取出进行细胞计数。根据平板上菌落数，计算出对照样品1mL菌液中的活菌数。存活率二处理后1mL菌液屮活菌数十对照1mL菌液小活菌数1.致死率致死率二（对照1mL菌液屮活菌数一处理后1mL菌液屮活菌数）/对照1mL菌液小活菌数2.突变率自发突变率=诱变前样品H'Str抗性菌数/诱变前活菌数突变率=后培养以后样品i

6、-Str抗性菌数/后培养以后样品屮的活菌数同样计算用紫外线处理5s、10s、15s、后的存活细胞数及致死率。（三）诱变后

7、培养1.取lmL诱变处理好的菌悬液接入肉膏蛋白豚液体培养基屮进行后培养，37°C120rpm摇瓶避光培养；2.对后培养的菌悬液进行平板菌落计数。（四）菌株的筛选1.将经过诱变后培养的菌悬液适半稀释后，分别涂布于含最小抑制浓度的链霉索培养基平板上，37C培养长出的菌落即为链霉素抗性突变株。2•计抗性菌落数，计算诱发突变率，观察紫外诱变的效果。五、实验数据记录与处理（-）将实验结果按表要求如实填入，并分别算出存活率，致死率。表1紫外线处理后枯草芽泡杆菌的存活率及致死率照射时间5秒10秒15秒稀释倍数菌落数平均菌落数存活率/%致死率/%对照组稀释倍数菌落数平均菌落数存活率/%致死率/%