对于脱磷给您几个建议供您参考.doc

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1、对于脱磷给您儿个建议供您参考：1、NEB的CIP最适缓冲液为NEBuffer3,其在NEBuffer2、NEBuffer4以及EcoRI反M缓冲液屮也均冇活性。所以您可以根据您酶切的体系来肓接进行脱磷反应。冇一点需要注意一下，如果您所使用的缓冲液屮的盐浓度低于50mM,则要将CIP的酶量加倍。2、在用CIP脱磷Z示，要通过胶冋收、柱离心或者酚抽提的方法纯化DNA,因为CIP无法进行热失活；3、选用热敏磷酸酶（M0289），此磷酸酶在65度加热5分钟就可以完全失活，也就省去了纯化的麻烦，肓接进行连接就可以了。另外对于您说的平端连接，H连接效率较较粘端连接很低，但只要条件摸好了，应该也是可以的。一

2、定要注意载体和插入片段的比例。您也可以用高浓度的连接酶或者快速连接kit,能够简化平端连接步骤和条件，缩短连接时间，提高连接效率。以下就NEB的连接酶给您几点建议。1T4DNAligaseismostactiveatatemperatureof22C・2、T4DNAligasehasarelativelyshorthalf-lifeat22C.ForreactionIongerthan4hours,incubationat16Cisrecommendedsincelittleactivitywouldremainifincubatedat22Cafter4hours.Digestionatte

3、mperaturesabove25Cisneveradvisablesincethehalflifetothisligaseisgreatlydiminished.3xForligationofcohesive-endedDNAtherate-limitingstepisnotenzymaticactivityofT4DNAligase,butrather,thearmealingofoverhangs.Thus,tomaximizetherateofreaction,werecommendmaximizingtherateofthisstep,whilestillretainingsuffi

4、cientligaseactivity・Incubationat16CsignificantlyincreasestherateofoverhangannealingwhileonlyslightlyslowingLigaseactivity;thisresultsinanethigherefficiencyofligation.Incontrast,forligationofblunt・endedDNAfragments,armealingofoverhangsdoesnotoccursothisrate-limitingstepdoesnotapply.Thus,forligationof

5、blunt-endedDNAfragmentswechoosetomaximizeT4DNAligaseactivitybyincubatingat20Cfor2to4hours.Alternatively,youcanperformblunt・endedligationsat16Cfor16hourstoobtainasimilarresult・