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1、电泳设备(一)电泳的基本原理 生物大分子如蛋白质,核酸,多糖等大多都有阳离子和阴离子基团,称为两性离子.常以颗粒分散在溶液中,它们的静电荷取决于介质的H+浓度或与其他大分子的相互作用.在电场中,带电颗粒向阴极或阳极迁移,迁移的方向取决于它们带电的符号,这种迁移现象即所谓电泳. 如果把生物大分子的胶体溶液放在一个没有干扰的电场中,使颗粒具有恒定迁移速率的驱动力来自于颗粒上的有效电荷Q和电位梯度E.它们与介质的摩擦阻力f抗衡.在自由溶液中这种抗衡服从Stokes定律. F=6πrvη 这里v是在介质粘度为η中半径为r的颗粒的移动速度.
2、但在凝胶中,这种抗衡并不完全符合Stokes定律.F取决于介质中的其他因子,如凝胶厚度,颗粒大小,甚至介质的内渗等. 电泳迁移率(mbility)m规定为在电位梯度E的影响下,颗粒在时间t中的迁移距离d. d m=------------或m=V/E t·E 迁移率的不同提供了从混合物中分离物质的基础,迁移距离正比于迁移率. (二)影响电泳的因素 1.电泳介质的pH值 溶液的pH值决定带电物质的解离程度,也决定物质所带净电荷的多少.对蛋白质,氨基酸等类似两性电解质,pH值离等电点越远,粒子所带电荷越多,泳动速度越快,反之越
3、慢.因此,当分离某一种混合物时,应选择一种能扩大各种蛋白质所带电荷量差别的pH值,以利于各种蛋白质的有效分离.为了保证电泳过程中溶液的pH值恒定,必须采用缓冲溶液. 缓冲液的离子强度 溶液的离子强度(Ionintensity)是指溶液中各离子的摩尔浓度与离子价数平方的积的总和的1/2.带电颗粒的迁移率与离子强度的平方根成反比.低离子强度时,迁移率快,但离子强度过低,缓冲液的缓冲容量小,不易维持pH恒定.高离子强度时,迁移率慢,但电泳谱带要比低离子强度时细窄.通常溶液的离子强度在0.02～0.2之间. I=1/2∑CiZi2(I:离子
4、强度;Ci:离子的摩尔浓度;Zi:离子价数.) 0.154MNaCl溶液的离子强度为: I=1/2(0.154×12+0.154×12)=0.154 0.015MNa2SO4溶液的离子强度为: I=1/2(0.015×2×12+0.015×22)=0.045 3.电场强度 电场强度(电势梯度Electricfieldintensity)是指每厘米的电位降(电位差或电位梯度).电场强度对电泳速度起着正比作用,电场强度越高,带电颗粒移动速度越快.根据实验的需要,电泳可分为两种:一种是高压电泳,所用电压在500～1000V或更高.由
5、于电压高,电泳时间短(有的样品需数分钟),适用于低分子化合物的分离,如氨基酸,无机离子,包括部分聚焦电泳分离及序列电泳的分离等.因电压高,产热量大,必须装有冷却装置,否则热量可引起蛋白质等物质的变性而不能分离,还因发热引起缓冲液中水分蒸发过多,使支持物(滤纸,薄膜或凝胶等)上离子强度增加,以及引起虹吸现象(电泳槽内液被吸到支持物上)等,都会影响物质的分离.另一种为常压电泳,产热量小,室温在10～25℃分离蛋白质标本是不被破坏的,无需冷却装置,一般分离时间长. 4.电渗现象 在电场中液体对于一个固体的固定相相对移动称为电渗.在有载体的电
6、泳中,影响电泳移动的一个重要因素是电渗.最常遇到的情况是γ-球蛋白,由原点向负极移动,这就是电渗作用所引起的倒移现象.产生电渗现象的原因是载体中常含有可电离的基团,如滤纸中含有羟基而带负电荷,与滤纸相接触的水溶液带正电荷,液体便向负极移动.由于电渗现象往往与电泳同时存在,所以带电粒子的移动距离也受电渗影响;如电泳方向与电渗相反,则实际电泳的距离等于电泳距离加上电渗的距离.琼脂中含有琼脂果胶,,其中含有较多的硫酸根,所以在琼脂电泳时电渗现象很明显,许多球蛋白均向负极移动.除去了琼脂果胶后的琼脂糖用作凝胶电泳时,电渗大为减弱.电渗所造成的移动
7、距离可用不带电的有色染料或有色葡聚糖点在支持物的中心,以观察电渗的方向和距离.
