胡萝卜与黄粉虫抗冻蛋白基因融合在拟南芥中的表达与抗冻性分析.pdf

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1、ExpressionandantifreezefeatureanalysisoftheDaucuscarotaandTentbriomolitorfusionantifreezeprotein(AFP)geneinArabidopsisthalianaZHANGZhenhuaAthesissubmittedinpartialsatisfactionoftheRequirementsforthedegreeofMasterofScience1nCellBiology1nCentralSouthUniversityofForestryandTechnology498ShaoshanSouthRoa

2、d，TianxinDistrictChangshaHunan410004，ER．CHINASupervisorProfessorCHENJienanandWANGYiqiangApril，2011中南林业科技大学学位论文原创性声明lIIITIIIIIIIIIIIlY1913524本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体己经发表或撰写的成果作品，也不包含为获得中南林业科技大学或其他教育机构的学位或证书所使用过的材料。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均己在文中以明确方式表明。本人完全意识到本声

3、明的法律后果由本人承担。作者签名：和承筚y，1年1月]日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件或电子版，允许论文被查阅或借阅。本人授权中南林业科技大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。本学位论文属于：1、保密口，在年解密后适用本授权书。2、不保密瓯潸鬻嚣q’’、⋯：形旁彳作者签名：鼢导师签名：∥纱孑1Vtf年占月]日9勺／／年易月7日摘要植物在遭遇冻害时，细胞内环境脱水、结晶，从而造成细胞物理性损害或死亡。而植物要抵抗冻害，需要

4、具备两个最基本的要素：一是避免细胞内结冰；二是提高细胞膜结构及核酸蛋白质等生命物质的低温稳定性。而细胞外结冰和细胞液的过冷却则是植物避免细胞内结冰伤害的最主要和最普遍的两种适应机制。抗冻蛋白(antifreezeprotein，AFP)是一种具有阻止体液内冰核形成与生长、维持体液非冰冻状态的高效抗冻物质，最早是由美国加利福尼亚大学的DeVries在20世纪60年代从极区海鱼的血清中发现的，能够有效地提高植物的抗冻性。本研究以胡萝卜和黄粉虫为材料，依据NCBI登录号号AJl31340和AFl591l4基因序列分别设计特异引物，采用RT-PCR方法克隆到胡萝卜抗冻蛋白基因(DcAFP)和黄粉虫抗冻

5、蛋白基因(TmAFP)cDNA全序列。通过重叠延伸PCR，将两个基因前后串联起来构建成融合基因Dc．TmAFP和Tm—DcAFP，并构建了植物表达载体，通过农杆菌介导转化模式植物拟南芥，并成功获得四个基因的转基因拟南芥。四个外源目的基因在转基因植株中的转录量经Real．timePCR试验分析，同野生型相比都得到了超量表达，证明4个基因已成功转入拟南芥中。本研究对转基因拟南芥进行抗冻实验处理，并进行了存活率统计和叶片黄花率统计分析。存活率分析结果表明野生型植株同转DcAFP、TmAFP、Dc．TmAFP和Tm．DcAFP基因植株存在显著差异；Tm．DcAFP亦同DcAFP、TmAFP、Dc．Tm

6、AFP基因植株存在显著差异。其中以转DcAFP基因的植株存活率最高，为86．387％；转TmAFP、Dc．TmAFP、Tm．DcAFP基因的植株平均存活率分别为86．079％、85．923％和78．993％；野生型植株存活率为0。依据存活率统计排列各基因型耐冻性从高到低顺序为：DcAFP&TmAFP&De．TmAFP>Tm．DcAFP>WT。叶片黄花率分析结果表明：转TmAFP基因同转DcAFP、Dc．TmAFP和Tm．DcAFP基因植株存在显著差异；转Dc．TmAFP基因同DcAFP和Tm．DcAFP基因植株亦存在明显差异；转DcAFP和Tm．DcAFP基因植株之间无明显差异。其中，以转Tm

7、AFP基因存活植株叶片黄化的黄花率最低，为41．966％：转Dc．TmAFP基因存活植株叶片黄化的黄花率最高，为86．369％；转DcAFP基因和Tm．DcAFP基因存活植株叶片黄化的黄花率分别为57．97％和54．622％。依据存活植株叶片黄花率统计排列各基因型抗冻性从高到低顺序为：TmAFP>Tm—DcAFP&DcAFP>Dc．TmAFP。通过存活率和叶片黄花率统计分析结果表明，不同功能的抗冻