DB34∕T 2905-2017 辣椒疫霉菌检测鉴定方法.pdf

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1、ICS65.020B20DB34安徽省地方标准DB34/T2905—2017辣椒疫霉菌检测鉴定方法MethodfordetectionandidentificationofPhytophthoracapsici文稿版次选择2017-06-30发布2017-07-30实施安徽省质量技术监督局发布DB34/T2905—2017前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由安徽省农业科学院植物保护与农产品质量安全研究所提出。本标准由安徽省农业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：安徽省农业科学院植物保护与农产品质量安全研究所、

2、霍山县百草林石斛发展有限公司、寿县农业技术推广中心、宿州市植检植保站、安徽农业大学植保学院、徽州区西溪南镇政务中心、霍山县农业技术推广中心、鸠江区农业技术推广中心、铜陵农业循环经济试验区农技站。本标准起草人：戚仁德、赵伟、迟元凯、戚士胜、马书芳、潘月敏、张建喜、吴军、汪涛、朱德慧、陈晴晴、刘浪、郑仁兵、唐文、刘继荣、汪海洋、李汪洋。IDB34/T2905—2017辣椒疫霉菌检测鉴定方法1范围本标准规定了辣椒疫霉的分离、形态学和PCR检测鉴定方法。本标准适用于辣椒、南瓜、西葫芦、西瓜、甜瓜等疑似病株上辣椒疫霉的检测鉴定。2鉴定依据以辣椒疫

3、霉引致病害的症状、病菌形态学特征、PCR反应结果等为鉴定依据。辣椒疫霉的形态学特征及其所引致病害的症状参见附录A。3培养材料准备3.1培养基准备3.1.1基础培养基基础培养基可选胡萝卜培养基、燕麦培养基、V8培养基等中的一种。——胡萝卜培养基：将200g新鲜的胡萝卜切成小片，加去离子水500mL，捣碎后用4层纱布过滤去渣，补水至1000mL，加琼脂粉20g，煮沸待琼脂熔化后分装，在121℃下高压蒸汽灭菌20min，冷却后备用。——燕麦培养基：称取燕麦片30g,加水1000mL，在60℃下水浴1h，双层纱布过滤去渣。上清液补水至1000m

4、L，加入琼脂20g，煮沸待琼脂熔化后分装，在121℃下高压蒸汽灭菌20min，冷却后备用。——V8培养基：量取100mLV8汁，加去离子水900mL、CaCO30.2g、琼脂20g，在121℃下高压蒸汽灭菌20min，冷却后备用。——液体培养基：将上述某一种基础培养基与去离子水按1:9比例稀释，在121℃下高压蒸汽灭菌20min，冷却后备用。3.1.2选择性培养基将某一种基础培养基冷却至50℃～60℃时，按每升培养基需青霉素50mg、五氯硝基苯50mg、多菌灵5mg和利福平100mg的比例加入，摇匀后备用。3.2对照菌株辣椒疫霉(Phy

5、tophthoracapsiciLeonian)菌株。4分离、纯化与孢子囊诱导4.1分离与纯化1DB34/T2905—2017将新鲜病组织表面用自来水冲洗干净，稍凉干，从病健交接部位将病组织切成约2mm×2mm的小块，沿培养皿周缘直接置于选择性培养基平板上，在培养箱中25℃～28℃条件下培养2d～3d，待菌落形成后，将培养皿底朝上置于低倍显微镜下观察，若分离物的菌丝无隔膜，则从菌落边缘挑取少量的菌丝，转接至不含任何药剂的基础培养基上，在同样温度条件下培养3d后，从菌落边缘切取菌丝块分别转接到新的基础培养基平板上和回接到健康的同种作物的相

6、同部位，选取导致与田间症状相同的分离物进行后面的操作。4.2孢子囊诱导将在基础培养基平板上生长5d左右的菌落切成大小约为10mm×10mm的菌丝块，移入灭菌后的空白培养皿中，将菌丝块的菌丝面朝上，再缓慢加入灭菌水，让水刚刚淹过菌丝面，再将培养皿置于日光灯下连续照光约48h。5形态学鉴定观察培养4d左右的菌落形态，并沿菌落边缘挑取少量菌丝，置于显微镜下观察菌丝的形态：如颜色、是否有隔膜、分枝情况等，与对照菌株和附录A描述的形态进行比对。再挑取经4.2处理的菌丝，置于显微镜下，观察是否产生了孢子囊和藏卵器。挑取产生了大量孢子囊的菌丝丛，放入

7、小试管内，加入0.5mL～1mL灭菌水，将试管底部撞击手心10余次，使孢子囊因震荡而脱落，吸取1滴孢子囊悬浮液，在显微镜下观察孢子囊及孢囊梗的形态、大小，乳突的有无，测量乳突厚度、孢子囊柄长度等，与对照菌株和附录A描述的形态进行比对、判断。6回接实验选取与取样作物相同品种的健康植株或组织5株（个），先在接种部位用接种针扎几个小孔，再3切取经纯培养的分离物菌丝块回接到创伤部位，也可用浓度为5×10个/mL的游动孢子悬浮液接种，接种后均需用浸水棉球保湿2d～3d，在25℃～28℃的条件下培养5d左右，观测是否发病、病害症状是否属典型的疫病症

8、状或与最初分离时的症状相似。接种发病后，再从病健交界处重新按4.1进行分离培养，观测其形态学性状与接种物是否相同。7PCR检测7.1病原菌基因组DNA的提取7.1.1分离培养物DNA的提取将纯培养的分离物在