胚胎培养箱澳大利亚Cryologic 胚胎冷冻仪==程序降温仪==程序控温仪.doc

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1、细胞如何保存?1.注意事项：1.1.欲冷冻保存之细胞应在生长良好(logphase)且存活率高之状态，约为80-90%致密度。1.2.冷冻前检测细胞是否仍保有其特有性质，例如hybridorna应在冷冻保存前一至二日测试是否有抗体之产生。1.3.注意冷冻保护剂之品质。DMSO应为试剂级等级，无菌且无色(以0.22micronFGLPTelflon过滤或是直接购买无菌产品，如SigmaD-2650),以5〜10ml小体积分装，4oC避光保存，勿作多次解冻。Glycerol亦应为试剂级等级，以高压蒸汽灭菌后避光保存。

2、在开启后一年内使用，因长期储存后对细胞会有毒性。1.4.冷冻保存之细胞浓度：1.4.1.normalhumanfibroblast:1〜3x106cells/ml1.4.2.hybridoma:1〜3x106cells/ml,细胞浓度不要太高，某些hybridorna会因冷冻浓度太高而在解冻24小时后死去。1.4.3.adherenttumorlines:5〜7x106,依细胞种类而异cAdenocarcinoma解冻后须较高之浓度，而HeLa只需1-3x106cells/mlo1.4.4.othersuspen

3、sions:5~10x106cells/ml,humanlymphocyte须至少5x106cells/mlo1.5.冷冻保护剂浓度为5或10%DMSO,若是不确定细胞之冷冻条件，在做冷冻保存之同时,亦应作一个backupculture,以防止冷冻失败。1.6.冷冻方法：161.传统方法:4oC10分钟—>-20oC30分钟—>-80oC16-18小时(或隔夜)—>液氮槽vaporphase长期储存。1.62程序降温：利用等速降温机以-1〜・3oC/分钟之速度由室温降至-120oC,放在液氮槽vaporphase

4、长期储存。适用于悬浮型细胞与hybridorna之保存。2.材料：2丄生长良好之培养细胞新鲜培养基DMSO(SigmaD-2650)无菌塑料冷冻保存管(Nalgene5000-0020)0.4%w/vtrypanblue(GibcoBRL15250-061)血球计数盘与盖玻片等速降温机(KRYO10SeriesII)3.步骤：3.1.冷冻前一日前更换半量或全量培养基，观察细胞生长情形。32配制冷冻保存溶液(使用前配制)：将DMSO加入新鲜培养基中，最后浓度为5-10%,混合均匀，置于室温下待用。依细胞继代培养之操

5、作，收集培养之细胞，取少量细胞悬浮液(约0」ml)计数细胞浓度及冻前存活率。离心，去除上清液，加入适量冷冻保存溶液，使细胞浓度为1-5x106cells/ml，混合均匀，分装于已标示完全之冷冻保存管中，lml/vial,并取少量细胞悬浮液作污染检测。冷冻保存方法1:冷冻管置于4oC10分钟—・20oC30分钟—-80oC16-18小时(或隔夜)—>液氮槽vaporphase长期储存。36冷冻保存方法2:冷冻管置于已设定程序之等速降温机中，再放入液氮槽中。程序为：program7:HBCELL