表面电性可控的磁性微球的制备、表征及其在基因组DNA萃取中的应用.pdf

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1、第42卷分析化学(FENXIHUAXUE)研究报告第11期2014年11月ChineseJournalofAnalyticalChemistryl598～1603DOI：10．11895／j．issn．0253-3820．140434表面电性可控的磁性微球的制备、表征及其在基因组DNA萃取中的应用黄华斌庄峙厦杨朝勇王小如(厦门华厦职业学院检验与科学技术系，厦门361024)(厦门大学化学化工学院，厦门361005)摘要运用水热法、Stober法制备了具有核壳型结构的超顺磁性Fe0@SiO微球，运用氨丙基三乙氧基硅烷(APTES

2、)对FeO@SiO微球表面进行修饰，得到表面电性可控的氨基化FeO@SiO磁性微球，运用透射、扫描电镜表征微球形貌，采用Zeta电位研究微球表面的荷电特性。将氨基化FeO@SiO：微球用于人类全血中基因组脱氧核糖核酸(DNA)的萃取，开发了固相萃取方法，并探究微球与DNA的作用机理，对提取产物进行凝胶电泳和PCR实验。结果表明，自制的微球成功地从全血中提取出纯度较高的基因组DNA，提取率约70％，微球对基因组DNA的饱和吸附量约为40ng，提取液可直接用于进一步的生物分析。关键词表面电性可控；磁性微球；DNA萃取1引言核酸提取

3、的传统方法，如酚一氯仿抽提法，存在溶剂毒性大、重复性操作多、难以实现微型化、自动化操作等缺点。近年发展起来的固相萃取法不仅可以避免使用毒性强的有机溶剂，而且能大幅度提高提取效率。磁性微粒作为一种新型核酸固相萃取剂，借助于适当的磁分离装置¨J，可以进一步简化和加速核酸的分离与纯化过程。利用外层表面改性的途径，可赋予磁性微球表面多种反应性官能团(如羟基、羧基、氨基、醛基等)J，通过吸附或共价键合的方式可以与酶、细胞、药物等生物活性物质结合；在DNA分离过程中，羟基、羧基与醛基一般以共价键的方式与DNA结合，结合时往往需使用盐酸胍等

4、试剂，由于强结合力，脱附时间比较长。与其它官能团相比，氨基与DNA结合后较易脱附。本研究运用水热法、St0ber法等方法制备了超顺磁的氨基化Fe，O@SiO：复合微球，应用电子显微镜、Zeta电位测量等手段对制得的复合微球进行表征，此微球具有表面电性可控的特点。与传统的依靠硅羟基与DNA强键合的微球相比，此微球可通过调节溶液的pH值控制微球表面的电性，从而改变DNA分子与氨基的静电作用力，进而控制DNA分子的吸附与脱附过程，更加简便快速地实现DNA的萃取，制备的微球成功用于全血中的基因组DNA的无损伤萃取。2实验部分2．1仪器

5、与试剂78—1型磁力加热搅拌器、JJ一1精密定时电动搅拌器(金坛顺华仪器有限公司)；超声仪(上海科导仪器有限公司)；电热恒温鼓风干燥器(上海精宏实验设备有限公司)；扫描电子显微镜(德国LEO公司)；透射电子显微镜(日本JEOL公司)；凝胶电泳仪、PCR仪(BIO．RAD公司)，NanoDrop．1000分光光度计(Thermo公司)，凝胶成像系统(美国Kadak公司)。正硅酸乙酯(TEOS，98％，上海百灵威化学技术有限公司)；氨丙基三乙氧基硅烷(APTES，Sigma公司)；其余试剂均为国产分析纯试剂；血样由厦门大学医院提供

6、；血细胞裂解液Invitrogen、蛋白酶K(Invitrogen)；TaqDNA聚合酶(TaKaRaBiotechnology)；琼脂糖(LP0028A，OxoidLtd．，Hampshire，England)；50bpLadder(Tiangen)；溴化乙锭(Sangon)；超纯水由Milli—Q纯水仪制得。扩增片段包括256bp，正引物5一TGCTYGTGAATTTFCTGAGACGGATG．3，反引物5．AACAGAACTACCCTG2014-05-22收稿；2014-0812接受本文系厦门市科技计划基金(No．350

7、2720123046)资助E—mail：ZZX@xmu．edu．1213第11期黄华斌等：表面电性可控的磁性微球的制备、表征及其在基因组DNA萃取中的应用微球在不同溶液中的电性因溶液pH值不同而20r异，低pH值时微球表面为正电性，此时溶液中如果l有负电性的DNA分子，则两者由于静电引力而吸lg附，当溶液的pH值较高时，微球表面的电性会转变砉。r_—L_————。为负电，此时，在其表面的DNA由于静电斥力而脱垂一10}pH目目离微球，作用机理推断如图7。，I

8、目3．3Amino—Si．MNPs用于基因组DNA的萃取l蜃3．3．

9、1全血中基因组DNA的萃取结果运用M)．一3『-翟1000分光光度计分析DNA的浓度与纯度。表1为一4oL不过同c批次制37欠．实验得结嚣：图6氨基化微球在4种不同溶液中的Zeta电位=50A260换算求得洗脱液的DNA浓度，计算溶Fig．6z。tp0t。ialnfi。i．F