基于离子液体修饰碳纳米管电极的碱性磷酸酶电化学检测.pdf

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1、第40卷分析化学(FENXIHUAXUE)研究报告第6期2012年6月ChineseJournalofAnalyticalChemistry835～840基于离子液体修饰碳纳米管电极的碱性磷酸酶电化学检测茹柿平吴坚一应义斌季峰(浙江大学生物系统工程与食品科学学院，杭卅I310058)(浙江大学医学院附属第一医院，杭州310003)摘要利用自制的离子液体修饰碳纳米管电极(CNTs—ILE)，在对CNTs—ILE的特性及对碱性磷酸酶(AP)酶促反应的底物磷酸对硝基苯酯(PNPP)和产物对硝基苯酚(PNP)进行电化学研究的基础上，采用安培法对酶促反应进程实现了持续动态的检测。实验表

2、明，CNTs-ILE的循环伏安特性优于传统玻碳电极，且它在检测PNP时呈现出良好的抗钝化特性。当AP浓度范围在1．0～100U／L时，电流大小与AP的浓度呈良好的线性关系。本方法可快速检测AP浓度，检测时间在20min内。CNTs—ILE具有良好的抗钝化、操作简单及制作成本低等特点，在碱性磷酸酶的检测领域中有望得到进一步发展。在传统ELISA基础上，利用CNTs-ILE对具体样本最终的AP酶促反应产物进行电化学检测，通过峰值电流大小确定抗原浓度，为检测以AP为标记酶的抗原和抗体提供了理论依据。关键词碳纳米管；离子液体；碱性磷酸酶；对硝基苯酚；磷酸对硝基苯酯；盐酸克伦特罗1引言

3、传统的酶联免疫技术(ELISA)是以光度法为检测手段，但光度法技术的灵敏度不高。电化学分析法具有较高的灵敏度和较低的检出限。目前，将高特异性的免疫分析与高灵敏度的电化学分析结合的电化学免疫分析方法得到了广泛应用。碱性磷酸酶(AP)是酶联免疫分析中较常用的标记酶之一。它作为标记物测定各种抗原和抗体，广泛应用于酶联免疫分析。它能催化磷酸单酯水解成无机磷酸盐和相应的醇或酚，具有转化率高、特异性范围宽的特点。可根据不同的需要选择不用的底物和测定方法，通过测定生成醇(或酚)的含量即可测定酶的活力。常用的检测AP的方法有光度法、化学发光法、荧光法和电化学分析法[2】。常见的用于检测AP的

4、电化学分析方法是以磷酸对硝基苯酯(PNPP)为底物，通过AP催化PNPP的反应，检测反应产物对硝基苯酚(PNP)的电化学信号B。这种方法有灵敏度高，重复性好，操作简单等优点】，目前也有很多关于AP和PNPP酶促反应的电化学检测方法报道[6]。然而，用于电化学检测的玻碳电极(GCE)对于检测酶促反应产物PNP存在着一个问题，即PNP在GCE表面易发生电聚合，导致电极钝化，从而使得GCE无法对PNP进行持续动态检测。为了解决这个问题，本研究采用自制的离子液体修饰的碳纳米管电极(CNTs—ILE)，利用安培法进行持续动态检测底物PNPP在AP催化下的反应产物PNP。碳纳米管具有很好

5、的电化学特性，在电化学检测中表现出良好的响应和抗钝化性能。而离子液体具有很高的稳定性和电导性，在电化学研究中广泛应用[11~15]。本研究组曾采用离子液体修饰的丝网印刷电极检测多巴胺【l6]，采用CuO纳米颗粒和离子液体修饰的碳糊电极检测过氧化氢。但是，采用安培法对AP酶促反应的进程进行持续动态检测还未有报道。2实验部分2．1仪器与试剂SK3300HP超声清洗器(科导公司)；BS224型电子天平(德国Sartorius公司)；单道移液器(德国201卜O7-14收稿；201卜11—24接受本文系国家科技专项(No．2009ZX08012-004B)资助E-mail：wujian

6、69@zju．edu．cn，jifeng1126@sina．tom836分析化学第4O卷Eppendorf公司)；CHI440电化学工作站(美国CHI公司)；SEM—Utra155扫描电镜(德国CorlzeisD公司)；三电极系统：Ag／AgC1参比电极，Pt对电极和自制的CNTs-ILE工作电极；酶标板(美国Costar公司)；MS3混匀器(德国IKA公司)；培养箱(宁波Safe公司)；碳纳米管(CNTs，北京纳辰科技发展有限责任公司)；玻碳电极(GCE，上海辰华仪器有限公司)。离子液体(IL，上海成捷化学有限公司)；酪蛋白(Casien)，Tris，碱性磷酸酶(AP)，A

7、P标记的抗鼠IgG(AP—Anti—mouseIgG，美国Sigma-Aldrich公司)；盐酸克伦特罗(CLB)，BSA标记的CLB抗原(BSA—CLB)和CLB鼠抗(Anti—CLB)，购自杭州隆基生物技术有限公司。对硝基苯酚(PNP)，KFe(CN)，Na：CO，，NaHCO，，KHPO，NaHPO，NaC1，KCI(国药集团化学试剂有限公司)；磷酸对硝基苯酯(PNPP)，阿拉丁试剂(上海)有限公司)；Tween-20(上海美吉生物医药科技有限公司)；所用试剂均为分析级以上。实验用水通过去离子水机