亲和超滤耦联液相色谱-质谱快速检测山楂叶中的α-淀粉酶抑制剂.pdf

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1、第41卷分析化学(FENXIHUAXUE)研究报告第2期2013年2月ChineseJournalofAnalyticalChemistry229～234DOI：10．3724／SP．J．1096．2013．20558亲和超滤耦联液相色谱．质谱快速检测山楂叶中的-淀粉酶抑制剂陶益陈锥张玉峰(浙江大学药物信息学研究所，杭州310058)摘要建立了用于快速检测山楂叶中一淀粉酶抑制剂的生物亲和超滤方法。考察了磷酸盐缓冲液的pH值、离子强度、孵育时间、孵育温度、一淀粉酶浓度等影响亲和超滤的因素，最终选择了10mmol／L磷酸盐缓冲液(pH74)作为孵育溶液，在37℃孵育45

2、min，淀粉酶浓度为10g／L。在优化条件下，将本法应用于山楂叶总黄酮的d一淀粉酶抑制剂的筛选，得到3个活性成分，分别鉴定为槲皮素一3-0一鼠李糖基一(1—)一葡萄糖基．(1—珥)一鼠李糖苷、牡荆素_2一葡萄糖苷、牡荆素_2．鼠李糖苷。这3个化合物的一淀粉酶抑制活性为首次报道。关键词亲和超滤；OL一淀粉酶；山楂叶1引言亲和超滤法是一种使用超滤膜把生物大分子(>10kDa的蛋白或DNA)和小分子化合物分离的方法。vanBreemen在1997年首先采用在线脉冲超滤．液质联用系统对组合化合物库进行筛选，选择人血清白蛋白和小牛肠道腺苷脱氨酶作为靶标，将混合物与靶标进行孵育

3、，使用脉冲超滤法分离靶标蛋白和混合物溶液，加入甲醇使靶标蛋白变性释放结合的配体，最后使用质谱对结合配体进行鉴定。配体解离常数在微摩尔级和纳摩尔级的化合物都能被该方法检测到，如人血清白蛋白的配体华法林、水杨酸、呋喃苯胺酸、甲状腺素及小牛肠道腺苷脱氨酶的配体红．9．(2一羟基．3．壬基)腺嘌呤等。在新药的发现过程中，脉冲超滤一液相色谱．质谱联用系统为组合化合物库的筛选提供了一种新的选择。脉冲超滤一质谱筛选方法的主要步骤有：(1)化合物与靶标分子进行孵育；(2)超滤分离靶标和未结合配体；(3)加缓冲液，清洗未结合配体；(4)加有机溶剂使靶标．配体复合物变性，解离出结合配体

4、，用液相色谱．质谱进行鉴定。研究者使用该筛选方法对一系列靶点(如癌症靶点、周期检测点酶、抗感染酶)进行了筛选，发现了很多先导化合物。这种超滤方法的缺点是必须将未特异结合的配体清洗干净，否则会影响结合配体的质谱检测。Sun等使用比较亲和超滤法对雌激素受体的结合配体进行了研究，避免了上述洗脱不干净的缺陷。OL．淀粉酶抑制剂能有效地抑制肠道内胰淀粉酶的活性，阻碍食物中碳水化合物的水解和消化，减少糖分的摄取，降低血糖和血脂含量水平，在治疗糖尿病、减肥等药物开发方面具有光明的前景。此外，一淀粉酶抑制剂作为一种新的起保鲜、防腐作用的食品添加剂，在食品领域也有较广泛的应用嘲。目前

5、，已经发现的OL一淀粉酶抑制剂主要来源于植物和微生物，植物来源的OL一淀粉酶抑制剂主要是黄酮类和酚酸类化合物[7]。山楂叶是蔷薇科植物山楂属植物山楂的干燥叶，其主要成分是黄酮类化合物如牡荆素、荭草素、牡荆素鼠李糖苷等化合物[8．。叶希韵等叫研究了山楂叶总黄酮对糖尿病小鼠血糖和血脂等生化指标的影响，证明山楂叶总黄酮具有显著降低糖尿病小鼠血糖和血脂的作用，并对糖尿病并发症和肝脏组织脂肪积累具有一定的防治作用。Wang等1]也对山楂叶黄酮提取物的血糖和脂质代谢调节作用进行了研究，发现其能显著抑制小鼠对碳水化合物和甘油三酯的吸收。上述研究提示，山楂叶总黄酮中可能存在着OL一

6、淀粉酶抑制剂。为了筛选新的OL一淀粉酶抑制剂，本研究采用亲和超滤法，以Or．一淀粉酶为靶点，对山楂叶总黄酮提取物进行筛选，通过比较加酶组和未加酶组的峰面积变化，观察到3个峰面积降低的峰，经质谱鉴定分别为槲皮素一3—0一鼠李糖基-(1—4)一葡萄糖基一(1—珥)-鼠李糖苷、牡2012-05-28收稿；2012-08-28接受本文系国家新药创制重大专项(No．2011zx09307_o02-o1)和国家自然科学基金项目(No．30830121)资助E—mail：zhangyf@zju．edu．ca230分析化学第41卷荆素葡萄糖苷和牡荆素鼠李糖苷这3个化合物。传统的ot

7、一淀粉酶抑制活性实验结果表明，这3个化合物都具有Ot一淀粉酶抑制活性。2实验部分2．1仪器与试剂1100液相色谱(美国Agilent公司)；Zorbax—C18色谱柱(250gmx4．6rnlrl，5gm)；LCQDecaXPpl离子阱质谱仪(美国Finnigan公司)；配有Xcalibur数据处理系统；制备液相色谱(日本岛津公司)；配有LC．8A泵、SPD．m20A检测器；ZorbaxSB—C制备柱(250mmx21．1min，7pm)，Amicon超滤管(美国Millipore公司，最大处理体积400gL，截留分子量10kDa)，离心机(德国Eppendor