化妆品微生物检测流程.docx

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1、凡在上述选择平板上有可疑菌落生长，经染色镜检，证明为革兰氏阳性葡萄球菌，并能发酵甘露醇产酸，血浆凝固酶试验阳性者，可报告被检样品检出金黄色葡萄球菌。霉菌和酵母金黄色葡萄球菌铜绿假单胞菌粪大肠菌群菌落总数1：10、1：100、1：1000分别取1：10、1：100、1：1000检液1ml注入两个平皿，注入融化并冷至45±1℃左右的虎红培养基，充分摇匀。翻转平板，置28±1℃培养72±2h，计数。若有霉菌蔓延生长，为避免影响其它霉菌和酵母菌的计数时，于48±2h应及时将此平板取出计数。吸取1:4新鲜血浆0.5mL，放入灭菌小试管中，加入待检菌24h±2h肉

2、汤培养物0.5mL。混匀，放36℃±1℃恒温箱或恒温水浴中，每半小时观察一次，6h之内如呈现凝块即为阳性。同时以已知血浆凝固酶阳性和阴性菌株肉汤培养物及肉汤培养基各0.5mL，分别加入灭菌1:4血浆0.5mL，混匀，作为对照。取上述分纯菌落接种到甘露醇发酵培养基中，在培养基液面上加入2-3mm的灭菌液体石蜡，置36±1℃培养24±2h。挑取分纯菌落，进行革兰氏染色镜检。被检样品经增菌分离培养后，经证实为革兰氏阴性杆菌，氧化酶及绿脓菌素试验皆为阳性者，即可报告被检样品中检出铜绿假单胞菌；如绿脓菌素试验阴性而液化明胶、硝酸盐还原产气和42℃生长试验三者皆为

3、阳性时，仍可报告被检样品中检出铜绿假单胞菌。取可疑菌落2-3个，分别接种在绿脓菌素测定培养基上，置36℃±1℃培养24h±2h，加入氯仿3-5mL，充分振荡使培养物中的绿脓菌素溶解于氯仿液，待氯仿提取液呈蓝色时，用吸管将氯仿移到另一试管中并加入1mol/L的盐酸1mL左右，振荡后，静置片刻。上层盐酸液内出现粉红色到紫红色时为阳性，表示被检物中有绿脓菌素存在。挑取可疑的纯培养物，接种在普通琼脂斜面培养基上，放在42±1℃培养箱中，培养24-48h，铜绿假单胞菌能生长，为阳性，而近似的荧光假单胞菌则不能生长。挑取可疑纯培养物，穿刺接种在明胶培养基内，置36

4、±1℃培养24±2h，取出放冰箱10-30min，如仍呈溶解状或表面溶解时即为明胶液化试验阳性；如凝固不溶者为阴性。挑取可疑纯培养物，接种在硝酸盐胨水培养基中，置36±1℃培养24±2h。小倒管中有气者即为硝酸盐还原产气试验阳性。用无菌玻璃棒挑取可疑菌落涂在氧化酶试纸片上，15-30s之内出现粉红色或紫红色时为试验阳性；不变色为氧化酶试验阴性。挑取可疑的菌落做革兰氏染色镜检，阴性应进行氧化酶试验。划线接种在十六烷三甲基溴化铵琼脂平板上，置36℃±1℃培养18-24h。根据发酵乳糖产酸产气，平板上有典型菌落，并经证实为革兰氏阴性短杆菌，靛基质试验阳性，则

5、可报告被检样品中检出粪大肠菌群。在蛋白胨水培养液中加入约0.5ml靛基质试剂，观察反应，玫瑰红色阳性，试剂本色阴性。取可疑菌落，做革兰氏染色镜检。取上述培养液1-2滴接种至蛋白胨水，置44±0.5℃培养箱内培养24±2h。如产酸产气。划线接种至伊红美蓝琼脂平板，置36±1℃培养箱内培养18-24h。灭菌吸管吸取10ml加入10ml双倍乳糖胆盐培养基，置44±0.5℃培养箱内培养24-48h。将45-50℃的卵磷脂吐温80营养琼脂倾注至平皿内，每皿约15ml，使检液与培养基充分混匀，并做空白，待琼脂凝固后倒置平皿于36±1℃培养箱内培养48±2小时(为区

6、分颗粒和菌落，可在每100ml琼脂中加入1ml0.5%的TTC溶液)将试管混匀，分别取1ml注入两个灭平皿，（如样品菌量高，再适当稀释）分别取检液1ml注入两个平皿和9ml生理盐水试管中。挑取培养物，划线接种在BairdParker氏培养基，，置36-±1℃培养24-48h。。挑取单个菌落分纯在血琼脂平板上，置36±1℃培养24±2h。1.水溶性的液体样品，直接配置1:10检液2.油性液体样品，10mL加5mL石蜡混匀，再加10mL吐温80，于40-44℃水浴震荡混合10min，加75mL生理盐水，继续在水浴中乳化，制成1:10悬液3.亲水性半固体状样

7、品，称10g加到有玻璃珠及90mL生理盐水的三角瓶中，振荡混匀静置15min，用其上清液作为1:10的检液4.疏水性半固体状样品，称10g放到研钵中，加10mL石蜡，磨成粘稠状，再加10mL吐温80，研磨溶解后，加70mL生理盐水，在40-44℃水浴中充分混合，制成1：10检液5.固体样品，称10g加到90mL生理盐水中振荡混匀，使其分散混悬，静置取上清液作为1：10的检液。6.如有均质器，亲水性半固体状样品等，可称10g加入90mL生理盐水均质1-2min；疏水性半固体状样品等，称10g加10mL石蜡，10mL吐温80，70mL灭菌生理盐水，均质3-

8、5min。吸取10ml加入90mlSCDLP液体培养基中，置36℃±1℃培养18-24h。