HPLC培训(峰与色谱条件).ppt

《HPLC培训(峰与色谱条件).ppt》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、HPLC高效液相色谱基本原理加样流动相流动相ACBBCA固定相——柱内填料，流动相——洗脱剂。HPLC是利用样品中的溶质在固定相和流动相之间分配系数的不同，进行连续的无数次的交换和分配而达到分离的过程。基本操作1.打开泵电源，待自检完成后打开“Purge”阀进行排液以除去泵头之前的气泡，排气完成后关闭“Purge”阀。按“Pump”键开启泵，然后按“func”及数字键以0.2ml/min的速度慢慢将流速调1.0ml/min（其中测甘油果糖氯化钠注射液时应以0.1ml/min的速度慢慢将流速调0.5ml/min）。2.一般柱平衡时间为30min左右

2、（测甘油果糖氯化钠注射液时平衡时间会更长些），此时依次打开检测器、工作站电源，打开计算机中工作站，待仪器自检连接完成后查看基线，如基线平稳即可进样采集数据。3.检测完成后，关闭计算机中工作站、检测器、工作站电源，将泵的流速慢慢降至0.2ml/min，按“Pump”键关闭泵，将流动相换至10%甲醇水或乙腈水，再以1.0ml/min流速冲洗色谱柱30-60min。4.最后将色谱柱充满纯甲醇保存。5.手动进样器使用后，用适当溶剂冲洗进样阀，除去残留的样品，溶剂，缓冲盐等，盖好封盖防止灰尘颗粒。流动相的配制①配制用水最好用蒸馏水（注射水）②称量、量取、调

3、pH时尽可能精确③流动相必须用0.45um滤膜过滤，注意区分有机膜、无机膜④加入甲醇或乙腈后要混合充分⑤流动相必须经过脱气（常用方法是超声脱气）⑥配制所用的试剂尽可能用色谱纯，如没有色谱纯可用分析纯代替⑦流动相应现用现配制，染菌的流动相禁止使用⑧配制过程中应注意自我保护流动相使用前为什么要脱气？流动相使用前必须进行脱气处理，以除去其中溶解的气体（如O2），以防止在洗脱过程中当流动相由色谱柱流至检测器时，因压力降低而产生气泡。气泡会增加基线的噪音，造成灵敏度下降，甚至无法分析。溶解的氧气还会导致样品中某些组份被氧化，柱中固定相发生降解而改变柱的分离

4、性能。常用的脱气方法比较：氦气脱气法加热回流法：效果较好，但操作复杂，且有毒性挥发污染。抽真空脱气法：易抽走有机相。超声脱气法：流动相放在超声波容器中用超声波振荡，超声过程中观察无气泡生成即可。在线真空脱气法：真空脱机利用膜渗透技术在线脱气，无需额外操作，成本低，脱气效果明显优于以上几种方法，并适用于多元溶剂体系。色谱柱的良好使用规范溶剂使用前必须过滤运输中变干了的色谱柱要完全浸湿（预处理）如果样品中含有无需考虑而保留强的组分时,必须进行前处理清楚了解色谱柱填料适用的pH范围(3-7)，温度(<60),化学适应性使用新鲜的水溶液,流动相现用现配制

5、定期用强极性溶剂冲洗色谱柱储存色谱柱时,要将缓冲液冲洗干净,并保存在适合的溶剂中,如甲醇、乙腈避免操作不当损坏色谱柱,如:猛敲,跌落或过紧拧接头最常用的“万能柱”填料为“C18”，简称“ODS”柱，即十八烷基硅烷键合硅胶填料（Octadecylsilyl，简称ODS）。这种填料在反相色谱中发挥着极为重要的作用，它可完成高效液相色谱70～80％的分析任务。由于C18(ODS)是长链烷基键合相，有较高的碳含量和更好的疏水性，对各种类型的生物大分子有更强的适应能力，因此在生物化学分析工作中应用的最为广泛。按键合到基质上的官能团可分为：⑴反相柱：填料为非

6、极性，官能团为烷烃，例如：C18(ODS)、C8、C4等。⑵正相柱：填料为极性，官能团为－CN氰基、－NH2氨基等。⑶离子交换键合相：阳离子官能团：－SO3H磺酸基、－COOH羧基等。阴离子官能团：―R4N＋季铵基、-氨基等。（由于硅胶基质的键合相只能在pH＝2～7.5的范围内使用，而离子交换色谱要求有更宽的pH范围，因此其基质现在仍主要使用聚苯乙烯和二乙烯苯）色谱柱的故障诊断--基线噪音可能的原因:1、流动相脱气不彻底2、检测器流通池污染或有气泡3、检测器光源能量不稳4、周期性噪音可能由泵的脉动引起5、电子放大电路不稳定Time(min.)色谱

7、柱故障诊断--基线漂移可能的原因梯度洗脱流动相不干净温度波动(对示差折光检测器影响更大)流动相与色谱柱未达到平衡系统中污染物流失电子线路不稳定检测器预热时间不够进样器中残留，硬件与流动相不相容，如Peek材料与不合适的有机溶剂合用色谱柱故障诊断--鬼峰鬼峰-—是指在未进样时也能出现的色谱峰原因：1、流动相不干净，尤其是弱极性流动相，RPC中水的纯度比甲醇影响更大；2、样品的交叉污染20%-100%MeOH6015301507色谱柱故障诊断--峰形问题可能的原因：1、色谱柱柱床塌陷，出现死体积2、过滤片部分堵塞3、两个组分共同流出，形成一个峰(DA

8、D)4、样品溶剂不匹配色谱柱柱床塌陷，出现死体积色谱柱故障诊断--峰形问题所有的峰都变宽1.柱效降低，柱床塌陷2.进样体积（质量）过大3