荧光基因发光原理.pdf

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1、TD9技术：稳态动力学，荧光能量共振转移(FRET)参考文献：Nature（2001）411，1065（FRET）AnnuRevBiochem（1998）67,509（GFP）I．稳态动力学概论如有需要可复习基础生物化学课本，如Voet&Voet，BiochemistryE+SÆE•SÆE+PE=酶，S=底物，P=产物下图示产物随反应时间的变化情况稳态时底物消耗量：[E•S]是恒定的，d[E•S]/dt=0稳态时的反应速度等式：v=kcat([E0][S]/(Km+[S]))Km=(k-1+kcat)/k1（定义）注意：当[S]趋近于

2、无穷大时，vmax=kcat[E]0同时，当Km=[S]时，v=½vmaxIle例：如何测定RS的Km和kcat值：IleIleIleIle+ATP+RSÆRS•Ile-AMPÆRS+tRNA-Ile+AMP共有三种底物（Ile，ATP和tRNA），因此有三个Km值。要测定Ile的Km值就加入过量的ATP和tRNA（使其饱和），然后用滴定法加入不同量的Ile。用产物量对时间作图，根据斜率计算其反应速度（斜率=反应速度）。再用反应速度对底物浓度作图，就很容易从图中得到Km值和kcat值。II．FRET（荧光共振能量转移）该法主要用于测定

3、两个荧光基团间的距离。―此法用于当一个荧光基团（供体）的发射波长与另一个荧光基团（受体）的激发波长有重叠时。―不是重吸收方法（没有媒介光子）―通过偶极-偶极反应染色—两个荧光团均处于激发状态。―不产生辐射以荧光素和罗丹明(Rhodamine)为例荧光素：λex=494nm，λem=514nm（供体）罗丹明：λex=528nm，λem=551nm（受体）把两个荧光基团都连接到同一蛋白质上。当这两个荧光基团都在494nm处被激发时，其发射谱出现两个峰。要把这两个荧光基团分开，可用胰岛素消化蛋白质的方法或者通过光褪色法去除受体。现在只有一个

4、与供体相应的峰，因为能量不再转移给受体，其强度（I）不断增加。FRET效率=E=1–(Idonor-beforeblench/Idonor-afterbleach)高FRET=褪色前大大增加=小部分=E接近1.0低FRET=褪色前仅少量增加=大部分=E接近0也可通过测定其寿命得到E值E=1–(τdonor-beforeblench/τdonor-afterbleach)666为计算两个荧光团间的距离，可应用FRET公式得到：E=R0/(R0+r)其中r=供体和受体间的距离R0=福斯特半径，即E=0.5时二者间的距离用E对r作图，可以得

5、到大多数染料在距离大约为R0（30~60Å）处的绝大多数信息—并容易地测定出蛋白质的直径。对所用的某种荧光团来说，其R0是特定的。III．GFP—绿色荧光蛋白为什么？―用特异性强的物质来标记蛋白质并可直接通过光学成像检测。特点：源自水母（GFP=FRETaupuorin-接受器→将蓝光转变为绿光）238个氨基酸11股反平行β-筒Ser65-Tyr66-Gly67形成发色基团（λex=395nm，λem=505nm，阴离子状态λex=475nm，λem=505nm）饱和时间为表达后1~4小时氧化较慢咪唑啉酮在空气中会发生缓慢的自氧化在缺

6、氧环境中不会形成荧光基团RFP=红色荧光蛋白特征―来自于珊瑚首先变成绿色，大约12小时后又变成红色质谱分析显示红色蛋白质比其绿色中间体小两个质量单位必须形成四聚体其它设计得较为合理的颜色有：黄色（YFP），蓝色（BFP），青色（CFP）EGFP=强绿色荧光蛋白，只有一个发射波长峰为475nm（S65T的变异体）→破坏与Glu222间的氢键，而促进其质子化→以稳定Tyr66的阴离子形式优点—GFP由基因编码（可与待测蛋白质结合并保持完整的特异性）缺点—太大GFP生色团―参阅文献AnnuRevBiochem(1998)67,509IV．F

7、RET-Ras活性的应用举例Nature(2001)411,1065GAPRas•GTP(“on”)Ras•GDP(“off”)GEFRas是一种GTP酶，在信号传导途径中其分子开关的作用。当开关打开时，Ras▪GTP与其下游效应分子相互作用，如RafRaf只与打开的Ras结合方法：合成参与形成分子内复合物CFP(cyan)-Raf-linker-Ras-YFP(黄色)的DNA导入细胞表达蛋白质成像参看Nature（2001）411,1065中的图1a，它显示与GTP和GDP结合时的蛋白质结构成像：激发CFP,接收YFP散射激发CFP

8、,接收CFP散射计算比值YFPem/CFPem→比率图在图中，红色代表高比率YFP/CFP→高FRET绿色代表低比率YFP/CFP→低FRET比较两篇报道：关于Ras活化的报道“Raichu-Ras”关于Rap1的报道“