DB34∕T 2071-2014 杂交玉米及亲本真实性鉴定DNA分析方法.pdf

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1、ICS67.060B22DB34安徽省地方标准DB34/T2071—2014杂交玉米及亲本真实性鉴定DNA分析方法IdentificationofgenuinenessofhybridcornanditsparentsusingDNAanalysismethod2014-02-17发布2014-03-17实施安徽省质量技术监督局发布DB34/T2071—2014前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由安徽省质量技术监督局提出，安徽省农业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：安徽省农业科学院水稻研

2、究所。本标准主要起草人：陆徐忠、杨剑波、倪金龙、刘勋辉、李莉、汪秀峰、马卉、张小娟。IDB34/T2071—2014杂交玉米及亲本真实性鉴定DNA分析方法1范围本标准规定了杂交玉米及亲本品种真实性鉴定SSR分子标记法的术语和定义、原理、试剂与溶液、主要仪器、操作步骤和结果判定。本标准适用于玉米单交种和自交系的品种真实性鉴定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T3543.2农

3、作物种子检验规程扦样GB/T3543.4农作物种子检验规程发芽试验GB4404.1粮食作物种子第1部分:禾谷类GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1品种真实性varietalgenuineness供检品种与文件记录(如标签等)是否相符。本标准中指品种间在DNA分子标记带型上的一致性。3.2标准样品standardsample经权威机构认定认证的代表已知品种特征特性的样品，对有性繁殖作物而言，一般为种子。4原理根据SSR序列两端保守的单拷贝序列设计特异引物，利用PCR

4、技术扩增每个位点的重复次数，通过电泳分析其长度多态性，进行杂交玉米及亲本的真实性鉴定。5试剂与溶液5.1仅使用分析纯试剂和符合GB/T6682规定的一级水。5.2β-巯基乙醇1DB34/T2071—20145.3异丙醇5.4剥离硅烷5.5四甲基乙二胺（TEMED）5.6TaqDNA聚合酶5.7PCR反应缓冲液（10×Buffer）5.825mmol/L氯化镁溶液（MgCl2）5.9DNA分析仪专用丙烯酰胺胶液5.10DNA分析仪专用分子量内标5.11DNA分析仪专用电泳缓冲液5.121mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸

5、溶液（Tris-Hcl）：称取121.1g三羟甲基氨基甲烷（Tris）溶解于800mL水中，用盐酸（HCl）调pH至8.0，加水定容至1000mL。在103.4kPa（121℃）条件下灭菌20min，4℃储存。5.1310mol/L氢氧化钠溶液（NaOH）：在160mL水中加入80.0g氢氧化钠（NaOH），溶解后，冷却至室温，再加水定容到200mL。5.140.1mol/L氢氧化钠溶液：2g固体氢氧化钠溶于450mL水中，加水定容至500mL。5.150.5mol/L乙二铵四乙酸二钠溶液（EDTA-Na2）（pH8

6、.0）：称取187.6g乙二铵四乙酸二钠（EDTA-Na2）加入800mL水中，再加入适量氢氧化钠溶液，加热至完全溶解后，冷却至室温，用氢氧化钠溶液调pH值至8.0，加水定容至1000mL。在103.4kPa（121℃）条件下灭菌20min，4℃储存。5.16十六烷基三甲基溴化铵提取液（CTAB）：81.7g氯化钠和20g十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）溶于800mL水中，然后加入1mol/LTris-HCl100mL，0.5mol/LEDTA-Na240mL，定容至1000mL，4℃贮存。5.17TE缓冲液1：1m

7、ol/l三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液5mL，0.5mol/lEDTA-Na21mL，加HCl调pH至2.0，加水定容至500mL。5.18TE缓冲液2：1mol/l三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液5mL，0.5mol/lEDTA-Na21mL，加HCl调pH至8.0，加水定容至500mL。5.19氯仿+异戊醇混合液：体积比为24+1。5.2070％乙醇：量取70mL无水乙醇，加水定容至100mL。5.21SSR引物工作液：SSR标记序列信息参见附录A。用一级水分别配制终浓度均为20μmol/L的上、下游引物工作液。5.22d

8、NTPs混合溶液：浓度为2.5mmol/L的dNTPs混合溶液。5.235×Tris/硼酸电泳缓冲液（5×TBE）：分别称取50g三羟甲基氨基甲烷、27.5g硼酸溶于500mL水中，加入10mL0.5mol/LEDTA-Na2溶液，定容至1000mL,4℃储存。5.24加样缓冲液：在98mL去离子甲酰胺中加入250mg溴酚蓝（Bromophen