液相色谱-质谱联用在线测定3种植物激素.pdf

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1、第39卷分析化学(FENXIHUAXUE)研究报告第3期2011年3月ChineseJournalofAnalyticalChemistry367～371DOI：10．3724／SP．J．1096．2011．00367液相色谱一质谱联用在线测定3种植物激素曹进苗兰刘建勋戚雪勇SusanJMurch(中国中医科学院西苑医院实验中心，北京100091)(UniversityofBritishColumbiaatOkanagan，CanadaV1V1V7)(江苏大学药学院，镇江212013)摘要褪黑激素、复合胺及吲哚乙酸等神经递质在高等植物中的发现为

2、理解植物生理的机制提供了新的可能性。建立了一种在线制备方法，将样品粉末化后装填入小柱，利用水、甲酸水和甲醇一水在线预洗制备后，切换至分析流路，采用梯度洗脱及ESI源LCMS／MS检测植物中3种神经递质，每个样品的检测时间10min，较离线方法的分析时间缩短了l／2，且不损失方法的准确度及精密度；回收率较离线方法提高约4％。关键词褪黑激素；复合胺；吲哚乙酸；植物组织；液相色谱质谱联用引言人体内神经递质是在细胞间和应激系统问传递信息的物质。植物内部也存在与人体类似的可进行信号传递的物质，该类物质包括乙酰胆碱、酪氨酸、儿茶酚胺、吲哚胺和植物激素等，存

3、在于神经元中，应激情况下可释放进入细胞间。其中，吲哚胺是一类人体神经递质，由色氨酸衍生而来，包括复合胺和褪黑激素[L21。1995年，在高等植物中鉴定出褪黑激素【l4]；Murch等发现生长的植物中普遍存在褪黑激素。Chen等测定了108种中药中的褪黑激素；Manchester等阐发现樱桃中存在褪黑激素；Badria等在许多植物性食材中发现了褪黑激素；Reiter等_】伽定量测定了胡桃中的褪黑激素。吲哚胺的高保守性及褪黑激素在众多植物中的存在，揭示了该类物质对植物生长及生存中的重要性。褪黑激素是植物中的荷尔蒙、保护性抗氧化剂及黑白信号通路的重要

4、递质”]。同时，褪黑激素在治疗许多人类疾病的草药中起到抗氧化剂和神经调节的作用。通过同位素示踪法揭示了高等植物中的色氨酸是褪黑激素、复合胺及吲哚乙酸等神经递质的共同前体。内源性的褪黑激素同时也在生长激素代谓十相关的植物生理方面起重要作用。另外，上述3种植物神经递质在同一植物组织中的水平评价也是研究热点，这为阐释上述神经递质的信号传导途径提供了数据支持。液相色谱质谱联用技术(LC—MS／MS)可用于鉴定某些基质中褪黑激素或者评价其存在水平。从绿色植物中分离、鉴定及定量测定褪黑激素，由于其基质的复杂性而使LC—MS／MS受到限制[13。本研究组曾采

5、用液质联用方法，测定了高等绿色植物中复合胺、褪黑激素以及吲哚乙酸”，分别使用了3种不同离子源(电喷雾ESI、大气压化学电离APCI及大气压光致电离APPI)对植物组织中的3种主要植物神经递质进行了测定。但是在实际应用中发现，离线样品制备增加了测试周期，批量提取的溶液在等待分析的过程中会进一步代谢或分解，利用冷冻或者酸终止反应的方式可以部分解决上述问题，但容器吸附等因素的影响会随等待时间的延长而增大，有必要发展在线测定技术。本研究建立了植物在线分离测定技术，有效减小了测定误差，并缩短了分析周期，为准确监视植物中植物递质的水平提供了方法。2实验部分

6、2．1仪器与试剂Alliance系列HPLC及PremierLCTMS／MS质谱联用设备(加拿大Waters公司)，MasslynxV4．0数据系统。质谱仪的操作参数及方法验证参见[16】。褪黑激素、吲哚乙酸(IAA)和复合胺(SigmaChemical公司)，甲醇和乙腈(HPLC级，加拿大VWR201f06-23收稿；2010-l13接受*Email：caojin@tsinghuaorgcn368分析化学第39卷Scientific公司)，甲酸(分析纯，Sigma公司)。樱桃(果实)、蓝莓(果实)、贯叶连翘(SJ．Wort)及黄芩(Scute

7、llariabaicalensis)(后二者包括种子、叶、花、根茎和短枝)，采自加拿大Guelph大学温室，均为新鲜样品，称重后，减压真空干燥，真空包装，2O℃保存待用。2．2样品处理植物的果实、叶、花、根及种子等，打开包装后，室温放置，6O℃烘干20min，于室温下通干燥氮气，至样品完全干燥，称重后，切碎并低温研磨成粉状。操作中，果实及种子等含糖分及淀粉会产生粘稠状物质，需1：1(w／w)添加惰性硅胶后研磨成均匀粉末；叶、花、根等则可以直接研磨过筛，取50～80jam颗粒，备用。2．3色谱及质谱条件XterraCl8色谱柱(100mmx2．1

8、mmx3．5ktm，加拿大Waters公司)，柱温为30℃。流动相A为O．45％(V／V)甲酸，B为乙腈。梯度洗脱：0～3rain，0～7％3～6ra