单分子酶学研究进展.pdf

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1、第44卷分析化学(FENXIHUAXUE)评述与进展第9期2016年9月ChineseJournalofAnalyticalChemistry1437～1446DOI：10．11895／j．issn．0253-3820．160201；评述与进展；石；＼!单分子酶学研究进展徐艳孙乐乐高延静秦为为彭天欢李迪(中国科学院上海应用物理研究所，物理生物实验室，上海光源国家科学中心(筹)生物成像中心，上海201800)摘要源于20世纪90年代的单分子显微成像技术成功实现了对单分子酶的催化过程实时监控，此后单分子酶

2、学的研究进入了快速的发展时期，发现了多种酶的新单分子行为及反应机制。单分子酶学的研究能够发现隐藏于整体平均水平下的单个酶分子的个体行为，揭示了酶与底物作用的动态变化，加深了人们对各种生化反应的理解。关键词单分子；酶；核酸酶；荧光共振能量转移；荧光显微镜；综述1引言酶能够催化多种生理生化反应，是维持机体正常运转不可或缺的重要因素。尽管对酶的研究由来已久，但是人们一直持有疑问：酶在催化时如何动态变化?同种酶的不同个体之间是否存有差异?酶与底物如何相互作用?采用传统的测定方法很难回答这些问题，因为传统方法只

3、能测定溶液中无数个酶分子的平均值，是一个共性的表达，故而不能够反映单个酶分子的个性。20世纪90年代，科研人员开始尝试在室温条件下进行单分子成像等技术的研究¨～，此后不断发展完善的监测方法、成像技术以及单分子操纵手段等最终为室温条件下在单分子尺度上探索酶的功能提供了条件。基于荧光显微镜的单分子酶学研究可观测到单个酶在催化时的动态波动，因而可以从更深层次上挖掘酶的功能信息。近年来的单分子酶学的研究证实了在催化过程中酶自身结构是动态变化的。这就提出了一个新的问题，为什么酶结构会波动变化?众所周知，酶是由氨

4、基酸链构成的，而氨基酸链必须折叠成特定的构象才能够发挥酶的正常功能。然而在热运动情况下，酶为了维持特定的构象就必定会造成氨基酸链的波动J，而氨基酸链的波动也必定诱导酶的构象在一定程度上发生波动变化。这就解释了为什么酶会有不同的构象，并且每种构象都具有特定的活性。同时，酶的能级相图(Energylandscape)决定了酶热力学和动力学上可达到构象的个数、不同构象之间的比例以及构象之间相互转换的速率，酶可能在同一构象中翻转多次后才会向着在催化活性较低的构象改变，这就是酶在催化过程中产生记忆效应的原因。利

5、用荧光显微镜在单分子尺度上对某种酶的催化反应进行监测已成为一个重要的研究方向。通用的策略是首先通过某种方式将酶分子疏松地固定在界面上，然后加入反应溶液，利用荧光显微镜实时记录酶催化过程中所产生的某种荧光信号的变化，最后提取单个酶催化的荧光强度随时问变化的轨迹并进行数学分析，得出酶催化时的动态过程。采用此方法研究酶的催化时需要长时间i贝0定荧光状态的变化，由于受到测定方法的限制，因而选择研究体系时可从以下几方面人手：(1)酶自身荧光活性状态在催化过程中能够发生改变；(2)酶可以催化无荧光的底物生成荧光产

6、物；(3)底物易于标记荧光，酶在催化底物后生成荧光状态不同的产物；(4)酶自身或酶与底物标定FRET对，研究酶与底物的相互作用；(5)酶在催化反应前后受构象影响导致荧光强度变化巨大。单分子荧光显微镜可同时独立记录多个酶分子催化过程中荧光信号变化，通过统计学分析建立数学模型，可以得到单个酶分子在催化过程中的动态波动，为人们深入理解某个特定的催化体系提供具有统计学意义的理论支持。本文对蛋白质酶以及核酸酶的单分子研究进展进行了简单概述，以期加深读者对单分子酶学领域的理解。2016-03—18收稿；2016-

7、04—18接受本文系国家自然科学基金(Nos．21227804，21373260，31371015)，中国科学院青年创新促进会(No．2013174)，口腔疾病研究国家重点实验室开放课题(No．SKLOD2015OF05)资助项目E·mail：lidi@sinap．ac．cn1438分析化学第44卷2单分子酶学研究进展2．1单分子蛋白质酶研究进展利用x．射线晶体衍射等物理方法，人们能够高效解析酶的结构。尽管越来越多的酶的结构被解析出来，人们却一直抱有疑问：在催化过程中，酶究竟是如何工作的?它的功能与结

8、构究竟有着怎样的关系?而在1998年，Xie课题组报道了单分子水平上对胆固醇氧化酶(Cholesteroloxidase，COx)催化的研究后，这个谜题被揭开了一角。胆固醇氧化酶活性中心包含一个黄素腺嘌呤二核苷酸基团(Flavinadeninedinucleotide，FAD)，其氧化形式可以自发荧光，而其还原形式不具有荧光活性。在胆固醇氧化酶催化底物生成产物的过程中，活性中心的FAD基团被还原成还原型黄素腺嘌呤二核苷酸(Reducedflavinade