环境中多氯联苯的免疫检测方法研究.pdf

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1、分类号UDC密级编号上海交通大学博士后研究工作报告环境中多氯联苯的免疫检测方法研究陈寒玉工作完成日期：2Q!Q生垒旦：2Q12生12月报告提交Et期：2Q12生12旦环境中多氯联苯的免疫检测方法研究TheresearchoftheimmunoassaymethodsforPolychlorinatedBiphenylsintheenvironment博士后姓名：陈寒玉流动站名称(一级学科)：上海交通大学环境科学与工程流动站专业名称(--级学科)：环境科学研究工作起始时间：2010年4月研究工作结束时间：2012年12月2012年12月内容摘要多氯

2、联苯类环境污染物属于《斯德哥尔摩公约》中确定的2l类持久性有机污染物。因为其具有高的化学稳定性和脂溶性，易于在生物体内富集，在生物体内表现出了一定的类激素功能，对环境生物及人类健康已经形成了不可估量的潜在威胁。对其筛选及检测方法的研究已经成为国际上环境科学的研究前沿和热点课题之一。加强对多氯联苯类污染物的检测分析是对其进行环境风险评价及对它们实施防控的重要前提。目前，常见的检测方法有气相色谱法、高效液相色谱法和气质联用等色谱分析技术。但是这些仪器分析方法存在设备复杂、操作要求尤其是样品前处理要求苛刻、价格昂贵、测定周期长等缺陷，不适合于现场快速检

3、测和大批量分析。因此发展有效的生物分析技术是此类污染物检测方法未来的发展方向。酶联免疫分析及荧光定量免疫PCR技术由于其高特异性和高灵敏性而无需复杂的前处理过程，是很有发展前景的检测分析方法。在作者的博士论文“荧光定量免疫PCR技术检测多氯联苯类污染物研究’’的基础上，对该类污染物的酶联免疫法和荧光定量免疫PCR技术进行了进一步的完善和补充。主要侧重点放在了对多氯联苯类污染物的总量测定和分量测定的方法研究上。选用三种有代表性的多氯联苯PCBl2，PCB37，PCB77作为研究对象，根据免疫检测的技术要求，主要通过半抗原衍生物的设计和制备、全抗原和

4、抗体的制备与表征，采用酶联免疫和荧光免疫PCR技术，分别建立了两种多氯联苯的总量免疫检测新方法，并应用于实际样品的测定。课题的主要研究内容为：1、免疫原和包被原的制备：用活化酯法分别将三种多氯联苯半抗原与牛血清蛋白(BSA)偶联，制得PCBs的免疫原；用混合酸酐法将半抗原分别与卵清蛋白(OVA)偶联，制得PCBs的包被原。产物经紫外光谱、蛋白质含量测定等方法给予确证。2．多克隆抗体的制备：针对检测PCBs污染物的目的不同，采用免疫原对新西兰大白兔免疫的程序设计了两套程序：为了对环境中PCBs的分量进行测定，采用单一的PCBl2，37，77免疫原分

5、别对6只大白兔免疫，获得对单一PCBs特异性的抗体；为了对环境中PCBs的总量进行测定，采用三种免疫原以(v：v=l：1：1)的比例制备出复合免疫原对2只大白兔免疫，目的是获得一类具有族特异性的抗体。通过免疫新西兰大白兔，对血清进行分离和提纯，制备了四种效价高、特异性好的抗多氯联苯类环境激素的新抗体；3．生物素化探针DNA的制备和纯化：生物素化探针DNA是以pUCl9质粒为模板，在PCR扩增体系中加入两条生物素化了的引物，扩增得到的一段103个碱基对的生物素化DNA。4．生物素化抗体的制备：通过活化生物素法，把一种具有族特异性的多抗与活化生物素(

6、BNHS)进行偶联，产物经过透析纯化后，得到用来测定PCBs总量的特异性生物素化抗体；5、利用制备的单一PCBs多克隆抗体和人工包被原，优化相关反应条件，如PBS的pH值、DMSO含量，封闭液，酶标二抗的稀释倍数等后，建立了测定多氯联苯分量的PCB77的间接竞争ELISA方法，其线性范围为0．01—10099／L，检出限分别为：IC∞为0．056gg／L，并将该法用于测定东海近海岸沉积物中多氯联苯的含量，回收实验显示回收率在84％-112％之间。实验结果与GC／ECD的结果具有良好的一致性。6、建立了直接竞争实时定量免疫聚合酶链式反应(直接竞争r

7、t—IPCa)分析方法，用于环境PCBs总量的检测。在优化的扩增程序下，建立了直接竞争rt-IPCR分析方法标准曲线，对污染物进行检测，得到线性范围为lxl01-1x106pg／L，检出限为10．25pg／L，相关系数为O．98。应用于室内空气样品中多氯联苯的检测分析，并考察了方法的特异性及样品回收率，结果令人满意。与GC／lVlS测定结果比较，发现两者相关性较好，在误差范围内存在的差异是可以接受的。通过研究可知，间接竞争ELISA的检测灵敏度比直接竞争rt-IPCR低近100倍。直接竞争rt．IPCR的工作曲线有较好相关性。通过对实验过程各步骤

8、的检测条件优化发现，当采用O．8％的戊二醛溶液处理聚丙烯PCR管后，可以提高对包被原的吸附能力，同时各种包被介质和包被时间、最佳抗原抗体