核酸检测技术及质量控制王凤鸣资料.ppt

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1、核酸检测技术及质量控制常州市疾病预防控制中心王凤鸣目录一、PCR实验技术操作要点二、质量控制要点三、实验室生物安全管理一、PCR实验技术操作要点常用仪器设备加样器PCR实验室应备有4套连续可调加样器，分别用于试剂准备、样本处理、扩增和产物检测四个试验区。加样器的类型单道连续可调式移液器多通道连续可调式移液器单道连续移液器单道移液管配合使用的移液器加样器的使用加样器的校准校准方式计量局厂家自较时间视使用频率定（6个月-1年）加样器-注意事项根据所需取液量选择相应的移液器及吸头，基因扩增实验要求使用带滤芯的吸头，防止交叉污染。吸取液体时应缓慢匀速吸取

2、，避免液体溅到移液器头上；打出液体后拇指不应松开按钮，将吸液嘴压掉后再将拇指松开，避免液体回吸。在调整取液量的旋钮时，不要用力过猛，并应注意计数器显示的数值不要超过其可调范围。连续可调式移液器不可在无吸头时使用，吸头有液体时不可平放或倒置。加样器-注意事项（一）高速（冷冻）离心机电机转速最低转速最高转速转头消毒方式标准配件系统噪音高速（冷冻）离心机-使用方法离心机应放置在水平坚固的地板或平台上，并力求使机器处于水平位置以免离心时造成机器震动。打开电源开关，按要求装上所需的转头，将预先平衡好的样品放置于转头样品架上，关闭机盖。按功能选择键，设置各项

3、要求：温度、速度、时间、加速度及减速度，带电脑控制的机器还需按储存键，以便记忆输入的各项信息。待离心机完全停止转动时打开机盖，取出离心样品，用柔软干净的布擦净转头和机腔内壁，待离心机腔内温度与室温平衡后方可盖上机盖。机体应始终处于水平位置，外接电源系统的电压要匹配，并要求有良好的接地线。开机前应检查转头按装是否牢固，机腔有无异物掉入。离心机运行时，离心机周围30cm范围内不能有人和危险物品。挥发性或腐蚀性液体离心时，应使用带盖的离心管，并确保液体不外漏以免腐蚀机腔或造成事故。高速（冷冻）离心机-使用方法易燃易爆以及易与其他物质发生反应的物质不能离

4、心。在没有相应的防护措施时，不能离心有毒的、放射性的物质或病原微生物。离心机运行时不可人为地打开盖子。如果转头和盖子有可见的腐蚀或磨损的痕迹，则应立即停止使用。使用的玻璃或塑料离心管应能承受相应的离心力并大小合适。非金属转头不可用紫外照射。高速（冷冻）离心机-使用方法全自动核酸提取仪全自动核酸提取仪基于核酸的分子诊断技术病毒颗粒DNARNAFQ-PCRRT-FQPCR裂解荧光信号检测核酸提取荧光PCR检测系统荧光定量PCR检测加样病毒荧光定量PCR反应内容1份样品的量DEPC H2O2.875ulMasterMIX6.25ulRT-MIX0.12

5、5ul引物0.25ul探针0.25ul程序循环数温度反应时间115030min219515min3459515sec601min反应体系配置反应条件设置对照设置：阴性对照：灭菌双蒸水代替标本阳性对照：提取好的阳性核酸标本典型荧光定量PCR结果阳性标本扩增曲线阴性标本扩增曲线二、质量控制要点PCR实验技术的质量控制要点分子生物学实验室的质量控制涉及到整个基因检测扩增的所有阶段，确保检测结果的准确性和可靠性，严禁各类交叉污染事故的发生。PCR实验技术的质量控制要点PCR实验的过程主要包括：标本处理与核酸提取扩增试剂的准备核酸扩增与产物分析测定后的结果

6、报告PCR实验技术的质量控制要点高质量无污染无降解的核酸制备严格实行分区操作试剂储存和准备区标本处理和核酸制备区核酸扩增区扩增产物分析区实验人员的操作技能理想的PCR实验室分区设计模式产物分析区空气流向空气流向空气流向空气流向缓冲间缓冲间缓冲间专用走廊工作流向扩增区标本制备区试剂准备区各区独立注意风向因地制宜方便工作“十六字口诀”PCR实验室设计的一般原则标本处理与核酸提取的质量控制核酸提取试剂的选择核酸扩增试剂的选择试剂的分装保存试剂的配置对照的设立核酸扩增仪器扩增参数的设定扩增产物的检测与分析荧光定量普通凝胶电泳毛细管电泳污染的控制和预防常见

7、污染的来源控制污染的措施消除污染的措施三、实验室生物安全管理为什么关注实验室生物安全？三起SARS疫情后期的实验室感染事件2003年9月8日：新加坡国立大学实验室，在P3实验室同时开展西尼罗病毒与SARS病毒的研究，一位27岁华人研究员感染；2003年12月6日：台湾省国防大学预防医学研究所，一名47岁的中校研究员，在P3实验室内清理SARS实验后的废弃物时，未戴手套，因而感染；2004年4月22日：中国CDC病毒所，跨室开展SARS病毒研究，并引发三代、9例病例、1例死亡；另有两例“隐性”感染者。引起实验室生物污染的原因很多很多人员生物安全概念

8、薄弱和技术操作不当；生物安全柜和高压灭菌容器的不正常使用或使用不当；样品传递、接受和使用、装有冻干感染性物质安瓿的打开；匀浆器、组织研磨