细胞培养污染问题及解决方案.doc

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1、一、细菌污染状态：细菌在普通倒置显微镜下为黑色细沙状，根据感染细菌的不同，可有不同的外形，培养液一般会浑浊变黄，对细胞生长影响明显。预防和补救：1.仔细检查一下器皿的灭菌情况，是否在高压灭菌时放气时间和压力足够！尤其是和储存培养液接触的移液管等物品，连续两次污染的话有可能造成储存液污染，一定要检查培养液是否存在浑浊现象！2.可在培养液或血清中加支原体预防剂。3.若细胞一旦污染，建议加支原体清除剂，能清楚常见的革兰氏阴性和阳性菌。二、霉菌及真菌污染状态：肉眼观察培养基发现培养基颜色基本无变化，不浑浊，但是培养基中由絮状漂浮物，显微镜下观察，若感染真菌

2、可看到分叉细丝状的结构（不同种类结构不同），若感染霉菌显微镜下可看到片状的结构，不透明，真菌及霉菌对影响细胞的生长影响不大。预防和补救：1.保证细胞房的干净整洁，干燥的环境(潮湿的环境利于霉菌及真菌的生长)。2.控制外来人员进出实验室。3.对实验室及培养箱进行彻底消毒。4.若细胞非常珍贵，且不易获得，可以对污染的细胞采取如下操作。悬浮细胞：收集细胞并离心，用PBS漂洗，重复此操作数次。贴壁细胞：用PBS轻轻冲洗细胞，丢弃，重复此操作数次。三、支原体感染状态：镜下黑色，多为多形，培养液一般会浑浊，国内血清很多没做支原体阴性检测，而支原体是牛血清中最常

3、见的微生物之一。而且它不能用过滤的办法除去。支原体感染细胞以后，细胞病变不很明显，只是慢慢死去。预防和补救：预防：实验室新购买的血清及培养基需检测是否含有支原体，引进的新品种细胞需做支原体检测，向培养基中添加预防支原体的抗生素。补救：向培养基中添加抗生素，（如氧氟沙星10μg/ml、环丙沙星10μg/ml、卡那霉素20~50μg/ml、四环素10~50μg/ml、庆大霉素200μg/ml等抗生素），或者向培养基中添加支原体清除剂清除支原体数天。四、黑蛟虫状态：可以穿透滤膜，也可以通过空气传播，低倍下为黑色点状，高倍镜下可看见黑色的小虫游来游去，培养

4、液不浑浊，一般不会太影响，细胞还可以用。常常可在同一批号的血清养的细胞中发现类似现象。预防和补救：一般黑胶虫不会影响细胞的生长状态，可以尝试改变培养基的品牌。血清冻融采取逐级冻融的方法。五、原虫感染状态：培养液可轻微浑浊，显微镜下那些细小的点状物数量非常多，轻微活动，细胞虽然可用生长但繁殖速度却明显减慢，而且细胞状态不好，边缘不清楚，细胞不透亮。他们与细胞可共生，但会与细胞争夺营养。这种共生是非常普遍的，但他们的数量小，细胞占优势所以不会影响到细胞的正常生长，只有当他们到达一定的数量时就会影响到细胞的生长，最终形成恶性循环。除以上污染源外，配液消毒

5、问题、操作问题也是污染原因之一。关于培养基的无菌状况，取培养基至培养瓶中（不加细胞），37度试培养一段时间后观察。如果没有细菌生长就是操作及细胞培养箱环境的问题。细胞操作及细胞培养箱环境问题如何解决？1、提高细胞操作技巧，禁止交叉使用枪头，在酒精灯火焰5公分距离内操作。2、定期对细胞培养箱消毒，培养箱水盘中的水也要定期更换，并使用无菌水。3、进入细胞房之前及在无菌操作台操作细胞实验之前需使用紫外灯照射30分钟。4、每次开培养箱之前需用酒精消毒双手。5、定期对培养箱进行消毒。6、配制的培养基需验证无菌后方可进行细胞培养。