甜菜抗除草剂转基因的研究.pdf

《甜菜抗除草剂转基因的研究.pdf》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。

1、中文摘要草甘膦是一种广谱灭生性、内吸传导型除草剂，由于其高效性、对人畜低毒、低残留、对生态环境影响较小，从而成为优秀的除草剂品种之一。草甘膦作用的靶标酶是5一烯醇丙酮酸莽草酸一3-磷酸合酶(5一enolpyruvyl-shiki—mate．3一phosphatesynthase，EPSPS)。EPSPS酶是芳香氨基酸生物合成过程中的关键酶，其作用原理为抑制植物体内芳香族氨基酸的生物合成，使芳香族氨基酸缺乏，从而扰乱生物体的正常代谢使其死亡。本研究通过加强抗草甘膦AtEPSPs基因使受体甜菜植株中的草甘膦靶标酶EPS

2、PS过量表达，因此转基因植株在吸收一定量的草甘膦后仍能进行正常的新陈代谢。利用提取的拟南芥cDNA为模板并设计引物，通过PCR扩增得到完整的抗草甘膦AtEPSPs基因片段。构建载体pMDl8．T-AtEPSPs质粒，将目的基因与载体pMDl8-T连接转化，得到携带载体pMDl8-T-AtEPSPs质粒的感受态细胞DH5a。为构建载体pBll21-AtEPSPs质粒而设计添加BarnHI和SacI的酶切位点的AtEPSPs基因引物，PCR扩增得到AtEPSPs(BamHIandSacI)基因片段，与克隆载体pMDl8

3、一T进行连接并转化，得到构建的中间载体质粒pMDl8-T-AtEPSPs(BamHIandSacI)。利用对8个不同基因型甜菜种子的培养和再生分化，得到了大量的甜菜无菌苗。通过对甜菜外植体的直接再生研究，建立了甜菜再生体系并优化了农杆菌介导体系的一系列最佳参数值。用农杆菌介导的方法将抗坏血酸过氧化物酶OsAPx8基因整合至甜菜基因组中。并获得了大量的抗性植株，对其进行PCR鉴定，可确定有31株为阳性抗性植株，PCR阳性率为44，9％。关键词：抗草甘膦AtEPSPs基因；甜菜；载体构建；抗坏血酸过氧化物酶OsAPx8

4、基因；农杆菌介导法啪删㈣flll

5、㈣lf}Ifll

6、l

7、埘洲洲Y2122453黑龙江大学硕士学位论文AbstractGlyphosateisabroad．·spectrumexcellentherbicideforitshighefficiency,lowtoxicityandresidue．EPSPSisthetargetenzymeofglyphosateanditisthekeyenzymeinaromaticaminoacidbiosynthesis．Glyphosateinterferesaromatic

8、aminoacidsynthesisinducearomaticaminoacidlacking．Thatcausesweedstodie．ThisresearchwasfocusedontheoverexpressionofEPSPSinBetavulgarisLinninordertomakeitgrownormallyafterabsorbglyphosate．UseATeDNAastemplateanddesignprimerswhichcontainedBamHIandSacIendonucleasesi

9、te．GotcompleteAtEPSPsbyPCR．ContructplasmidvectorpMD18．T-AtEPSPsandtransformDH5acompetentcells。GotBetavulgarisasepticseedingsfrom8genotypes．Optimizedagrobacterium．mediatedtransformationandestabfishedBetavulgarisregenerationsystem．InsertedOsAPx8intoBetavulgarisb

10、yagrobacterium．mediatedtransformation．PCRsho'wed31positiveplantsweregotandpositiveratewas44．9％．Keywords：AtEPSPs；Betavulgaris；vectorconstruction；OsAPx8：agrobacterium—mediatedtransformation．II．目录中文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯IAbstract⋯．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯

11、．．⋯．⋯⋯⋯．⋯⋯⋯⋯⋯．⋯⋯⋯⋯⋯．⋯⋯⋯．II第1章绪论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．11．1除草剂草甘膦的机理及其应用⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯11．1．1除草剂草甘膦的作用原理⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯11．1．2除草剂草甘膦的应用⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯31．2抗草甘膦转基因作物的