病毒中和抗体检测.doc

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1、病毒中和抗体检测1.病毒TCID50检测TCID50是指组织培养物（细胞）半数致死剂量。它有几个性质我们必须明白：1）它表示的是计量，不是浓度；2）它是一个单位；3）它的值等于1，实际上问它的值等于多少是一个没有意义的问题，就像问km的值等于多少一样，如果非要说出的的值等于多少，那我们只能说它的值在任何情况下都等于1。理解这三个性质对于理解TCID50非常重要，但是这三个性质经常被误解，所以导致对TCID50的理解出现偏差。首先我们来看一下这个表示法的意思：病毒滴度为108.2TCID50/ml。它表示的是每ml病毒溶液里含有108.2个TCID50的病毒，这和氯

2、化钠的浓度为4.5mol/L表示每L溶液中含有4.5个mol的氯化钠是一样的道理。经常可以听到人说我的病毒的TCID50是10x.x。这个说法是不科学的，应该说我这个溶液里含有10x.x个TCID50的病毒或者说我这个溶液的病毒滴度是10xxTCID50/ml。也可以说病毒的TCID50效价是10-x.x。TCID50=10^5.64/0.1ml。即：将病毒悬液作10^5.64稀释后，接种细胞0.1ml，可以使50%的细胞产生CPE。（将病毒悬液作10^5.64稀释后，0.1ml中含1个TCID50，作其他一些实验时（如中和试验），一般常用100TCID50/0.

3、1ml或者100TCID50/0.05ml）本方法的优缺点:①.优点:出现阳性结果时间较短,且较明显;②.缺点:有时候,在用枪头吸出细胞生长液时,容易出现污染;使用本方法时的注意事项:①.稀释病毒时,每做一个病毒稀释度都需要换枪头,减少浓度误差;②.96孔板,每孔接种的细胞量:一般在此种测定病毒滴度的方法下,要将细胞密度适当调低,至少要比正常传代时低一些,否则细胞生长速度过快,未到7天则细胞出现死亡,对观察CPE不利.一般情况下,小塑料瓶(8-9ml液体为正常用量),培养长慢单层后,消化细胞,加入6ml培养液,吹匀,吸出其中的2ml,到另外的瓶子,在该瓶中加入14

4、-16ml即可,如果不放心,可以用显微镜看一下,细胞数过多则补加培养液,少则补加剩余4ml的细胞悬液;维持液,即病毒培养液,配方为:①.MEM+2%小牛血清+3%谷氨酰胺+1%双抗+NaHCO3;②.MEM+3%谷氨酰胺+1%双抗+NaHCO3;两种维持液的不同在于是否有FBS(小牛血清).我个人曾经做过实验,在状态很好的细胞上接种病毒,分别使用两种不同的维持液,最终结果是一样的,没有什么不同,所以可以根据个人需要进行选择.另外,曾经请教过专门做中和实验的老师,他认为适当的FBS对细胞有保护作用,而且他说这是国外文献上的报道.1）细胞准备1.1检查培养瓶中的单层细

5、胞，以5ml胰酶－EDTA轻微冲洗1.2加入4－5ml胰酶－EDTA以覆盖单层细胞1.3放平培养瓶，37℃5％CO2培养箱中孵育10－20min，直到细胞脱落1.4加入5－10ml培养液，洗下细胞后移到离心管中1.5以PBS洗细胞两次（12000rpm,5min）1.6以D-MEM重悬细胞，并用血球计数板计数1.7以D-MEM将将细胞浓度调整到1×10^5/ml--1.5×10^5/ml1.8在微量培养板的各孔中加入100μl细胞,相当于?×10^4细胞/孔1.9在37℃5％CO2培养箱中过夜培养（18－22h），用处于生长相刚达到完全融合的细胞进行病毒的滴定2）

6、病毒制备3）病毒稀释3.1取冻存的病毒，以病毒生长培养液（VGM）稀释10倍，即100微升病毒液+900微升稀释液，共1毫升。（于1.5MLEP管中进行，将混合液充分吹打振荡，很重要！）3.2做10倍稀释3.3在另一新1.5MLEP管中加入100μl第一管稀释病毒液（1/10），按10的比例进行倍比稀释，再加入900μl稀释液，将混合液充分吹打振荡。以此类推共稀释至10^13倍。此过程中需要使用加样器和tip头。使用前用75%乙醇擦拭加样器，并用紫外线照射20min，确保无菌。使用新高压的tip头，外包装一定在超净台（或安全柜中打开）4） 病毒接种：4.1  取细

7、胞培养板，用多道加样器（又称排枪）吸去96孔板中的培养液，吸取孵育液或无血清DMEM加在每孔中再轻轻吹打一次，然后吸出孵育液（此步目的是去除血清，因为血清能干扰病毒的吸附）。4.2  于各孔中加100ul各不同的病毒稀释液，每个稀释度做一列孔，即每个病毒稀释度做8个平行复孔，根据观察的习惯，一般从右到左，从上到下，从高稀释度到低稀释度到原液加样。(病毒稀释度的选择10^3—10^12或者10^4—10^13,因为目的基因不同，重组腺病毒滴度差距很大，应该尽量将稀释度加大，看到有人用的稀释度是10^6—10^13)4.3  第11列和12列为阴性对照，阴性对照孔中加

8、入100u