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1、第5章染色体显微切割引言：在大部分人类肿瘤和某些特定人类遗传病中存在染色体重排。肿瘤特定的染色体异常会导致原癌基因产物的激活、肿瘤特异融合蛋白的产生或肿瘤抑制基因的失活。一个癌细胞的染色体共104条，包括许多异常的染色体Ph染色体示9；22易位（9q34;22q11）;→fi22q-;▲示9+Burkitt淋巴瘤的14q+染色体8q24;14q32易位一些肿瘤常见的染色体异常病名染色体异常慢性粒细胞白血病Burkitt淋巴瘤急性非淋巴细胞白血病慢性淋巴细胞白血病急性淋巴细胞白血病恶性淋巴瘤小细胞肺癌卵巢乳头状腺癌神经
2、母细胞瘤脑膜瘤Wilms瘤睾丸癌畸胎瘤Ph,即t(9;22)t(8;14),t(2;8),t(8;22)+8;7q,5q或-5t(8;21),t(15;17),t(9;22)；t(11;14),+12t(?;11),t(1;9),t(7;12),t(9;14)t(8;14),t(4;11),+21t(4;11),+1214q+,+12del(3)(p14-23)t(6;14)del或t(1;?)(p32-36;?)13q-22,22q11p1(12p)1(12p)染色体显带技术的建立，肿瘤非随机性染色体异常的细胞遗传
3、学分析已成为许多人类肿瘤诊断和预后不可或缺的指标，但常规显带染色体分析不能确定所有的细胞遗传学染色体重排。该技术的局限性阻碍了许多人类肿瘤，尤其是实体瘤核型的确定，但这种情况已被染色体显微切割和FISH技术所弥补。染色体显微切割已经成为由细胞遗传学分析快速过渡到分子检测的有力工具。细胞核移植技术：就是将供体细胞核移入除去核的卵母细胞中，使后者不经过精子穿透等有性过程即无性繁殖即可被激活、分裂并发育成新个体，使得核供体的基因得到完全复制。以供体核的来源不同可分为胚细胞核移植与体细胞核移植两种。1切开卵母细胞透明带2挤出
4、卵母细胞细胞核3注入供体细胞核4电融合仪融合培养12345显微操作仪嵌合体技术嵌合体(chimera)一词源于古希腊神话，其意是指狮头、羊身、龙尾等部分拼凑起来的怪兽。嵌合在生物学上是指同一个体中，基因型相异的细胞或组织混合存在的状态。现代的胚胎工程技术中，也有一种叫胚胎嵌合的技术。它是将２个胚胎细胞（同种或异种动物胚胎）合并，共同发育成１个胚胎，即“嵌合胚胎”，然后将这个胚胎移植给受体，让其妊娠产仔。如果产下来的幼仔具有以上２种动物胚胎的细胞，则称其为“嵌合体动物”。例如，用同一种类的黑鼠和白鼠胚胎嵌合，可生下黑白
5、相间的花小鼠；不同种类的绵羊和山羊胚胎细胞嵌合，可生下绵山羊，它既有绵羊的特征，又有山羊的特征。1囊胚显微注射法：用显微操作技术将供胚的全部内细胞团注入除去部分内细胞团的受胚囊胚腔中，或将供胚的部分内细胞团注入受胚的囊胚腔中，也可以向受胚囊胚腔中（或卵周间隙）注入16细胞至桑甚胚的卵裂球、胚胎干细胞或已分化的细胞，使其发育为嵌合胚胎的方法即为囊胚注入法。2.聚合法是指将去除透明带的两枚8细胞至桑葚期胚胎，或来自两个不同胚胎的卵裂球，或卵裂球与胚胎聚合在一起的方法。胚胎移植1.概念:将雌性动物的早期胚胎,或者通过其他方
6、式得到的胚胎,移植到同种的.生理状态相同的其他雌性动物的体内,使之发育为新个体的技术.供体：提供胚胎的个体。受体：接受胚胎的个体。染色体显微切割分手工切割和激光切割法，倒置显微镜上装配切割臂，安上硅化玻璃针，找到分散良好的分裂相来切割所需染色体片段。显微切割图例1.染色体显微切割技术的发展染色体显微切割最早起源于从一个特定的染色体区域分离出DNA标记，并首先成功地应用于果蝇多线染色体和小鼠染色体的研究。1981年，德国的欧洲分子生物学实验室（EMBL）Scalenghe等切割了果蝇唾液腺多线期X染色体第3段的几个片段
7、，通过蛋白酶消化、酚抽提、EcoRI酶切进行重组克隆。多线染色体：1984年染色体显微切割应用小鼠；1986年Bates等切割了人的2号染色体短臂。但当时由于所切割的染色体DNA量少，通常要切割上百条染色体，且其文库也只含几百个微克隆。由于无法直接扩增染色体DNA，所以必须在显微镜下反复切割若干拷贝的染色体，才能满足实验的要求这不仅费力耗时，而且要求实验操作人员必须具备熟练的染色体分带和鉴定经验，才保证实验的准确性。显微切割技术的突破在于它与PCR的结合，1989年Ludecke等切割了人类G显带染色体，结合PCR技
8、术进行体外扩增，使其工作量大大减小。对于同一条染色体，只要切割和收集5～10个拷贝，通过PCR扩增，即可满足实验要求。从而极大地提高了实验技术的可行性和准确性。在1989年，Ludecke等建立了一个显著提高克隆效率的方法。该方法首先用RsaI酶切显微切割的DNA，连接到一个用SmaI酶切的pUC载体，然后用PCR扩增插入位点两侧的载体序列。P
