DNA的半不连续复制.ppt

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1、尹泽群药实1201半不连续复制模型的提出与完善1968年冈崎提出DNA不连续复制模型，认为新合成的3‘→5‘走向的DNA链实际上是有许多5‘→3‘方向合成的DNA片断连接起来的。1978年Olivera提出半不连续（semidiscontinuous）复制模型，也就是说前导链上的合成是连续的，只有后滞链上的合成才是半连续的。现在已经弄清原来是由于细胞内都存在有dTTP和dUTP，而DNApolⅢ却并不能区分它们，因此也会将dUTP加入到DNA中，形成A·U对。那么在DNA中为什么没有U的存在呢？这是因为E.coli细胞里有双重

2、“保险”，防止了U的“混入”。第一道关是细胞里的dUTPase，它能使dUTP变成dUMP，dUMP是不能作为DNA合成的底物，这样它就不再能加入DNA中。但总还有些漏网之“鱼”，它们还是逃过此关，混入DNA中，这就靠第二道关来清除“异己”，这道关的主角是尿嘧啶N-糖苷酶（uracilN-glycosylase），它可以切断混合尿苷的糖苷键，形成无Pu和Py位点（apurinicorapyrimidinic，AP），再由AP内切酶在AP位点切出一个缺口，进一步进行切除修复。在细胞内尿嘧啶N-糖苷酶作用较快，而AP酶作用较慢，在新链

3、合成之初约1200bp就有可能掺进一个U，但很快就被尿嘧啶N-糖苷酶切断糖苷键，在AP酶未作用前在脉冲标记实验中就提取了，用NaOH沉淀时，AP位点十分易断裂，所以前导链也成了小片段。问题的提出DNA两条链反向平行，一条链走向为5‘→3‘，另一条链为3‘→5‘，但所有DNA聚合酶合成方向都是在引物3‘-OH上合成，使链从5‘→3‘延长，那么5‘→3‘链是如何同时作为模板复制呢？假设的提出新合成的3‘→5‘走向的DNA链实际上是有许多5‘→3‘方向合成的DNA片断连接起来的。脉冲标记实验（pulse-labelingexperi

4、ment）检测结果：1、被3H标记的片段，也就是新合成的片段，沉淀系数为20S左右，即都是长1000~2000Nt的DNA片段，而亲本链要比它大20~50倍2、先合成的（带标记）的DNA不再是短片段，而和总DNA的情况相似，沉淀系数为70S~120S较长的片段，这意味着刚开始合成的片段都是短片段，以后再连接成长片段得出结论DNA复制时，以3‘→5‘走向为模板的一条链合成方向为5‘→3‘，与复制叉方向一致，称为前导链；另一条以5‘→3‘走向为模板链的合成链走向与复制叉移动的方向相反，称为滞后链，其合成是不连续的，先形成许多不连续的

5、片断（冈崎片断），最后连成一条完整的DNA链。冈崎片段相对比较短的DNA链（大约1000核苷酸残基），是在DNA的滞后链的不连续合成期间生成的片段，这是ReijiOkazaki在DNA合成实验中添加放射性的脱氧核苷酸前体观察到的。复制叉DNA合成由RNA引物引发冈崎片断合成也需要引物。RNA引物的消除和缺口填补是由DNA聚合酶Ⅰ完成的，最后由DNA连接酶连接。DNA复制的复杂性保证了复制的高度忠实性E.coli复制时，每个碱基对错配频率为10-9~10-10，是高保真系统。新DNA链合成时需引物，引物后又要切除，再以DNA链

6、取代，DNA聚合酶在合成时还有校对功能，每引入一个核苷酸都要复查一次，未核实则不能继续进行聚合反应。在复制过程中还有许多辅助蛋白，E.coli就至少有15种。复制叉的复杂结构进一步提高复制准确性。DNA复制还存在正调控和负调控，调控分子可以是蛋白质，也可以是RNA。谢谢大家