血红蛋白的提取与分离课件.ppt

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1、血红蛋白的提取与分离一、课题目标本课题通过尝试对血液中血红蛋白的提取和分离，使学生能够体验从复杂体系中提取生物大分子的基本过程和方法，并了解色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理，为今后学习运用这些技术打下基础。二、课题重点与难点课题重点：凝胶色谱法,电泳法的原理。课题难点(自学)：样品的预处理；色谱柱填料的处理和色谱柱的装填。思考1为什么要分离蛋白？科研生产思考2蛋白质的分离和提取的原理是什么？根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质和对其他分子的亲和力等等，可以用来分离不同蛋白质。什么是色谱法，它的用途是什么？利用混

2、合物中各组分的理化生性质的不同（有哪些？），使各组分以不同程度分布到两相中的分离技术。叶绿素的分离。一、基础知识：㈠凝胶色谱法（分配色谱法）1、凝胶一些微小多孔的球体（内含许多贯穿的通道，由多糖类化合物构成,如葡聚糖、琼脂糖，具多孔的凝胶就叫分子筛）。2、凝胶色谱法的概念根据被分离的蛋白质相对分子质量的大小，利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，来进行蛋白质分离。讨论:为什么小分子必须走空隙3、原理：当不同的蛋白质通过凝胶时，相对（）的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程（），移动速度（）；而(）的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在（）移动，路程（），移动速度（），相对

3、分子质量不同的蛋白质因此得以分离。分子质量较小较长较慢相对分子质量较大凝胶外部较短较快课后思考:怎样选择交联度？层析系统:每一部件的作用思考:凝胶层析应该用那种柱子?电泳1、概念：指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。2、原理：许多重要的生物大分子，如（）等都具有()在()下，这些基团会带上（）。在电场的作用下，这些带电分子会向着与其（）电极移动。电泳利用了待分离样品中各种分子（）以及分子本身的（）、（）的不同使带电分子产生不同的（），从而实现样品中各种分子的分离。多肽、核酸可解离的基团正电或负电所带电荷相反的带电性质的差异大小形状迁移速度一定的PH思考:电泳与凝胶

4、层析驱动力的不同聚丙烯酰胺凝胶：是由单体丙烯酰胺和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺在引发剂(过硫酸铵）和催化剂（四甲基已二胺）的作用下聚合交联成的具有三维网状结构的凝胶。3、分类琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。测定（）时，通常用十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳。蛋白质相对分子质量为了消除净电荷对迁移率的影响可以在凝胶中加入()。SDS能使蛋白质发生完全变性。由几条肽链组成的蛋白质复合体在SDS的作用下会解聚成单条肽链，因此测定的结果只是()。SDS能与各种蛋白质形成蛋白质-SDS复合物，SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量。因而掩盖了不同种

5、蛋白质间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于()。蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带净电荷的多少以及分子的大小等因素。SDS单条肽链的分子量分子的大小SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）polyacrylamidegelelectrophoresis使用含有十二烷基硫酸钠（SDS）和还原剂（通常为巯基乙醇）的样品处理液对蛋白质样品进行处理（一般煮沸3～5分钟），通过加热和SDS可以使蛋白质变性，多亚基的蛋白质也将解离为单亚基。同时还原剂可以切断蛋白质中的二硫键（使二硫键还原）。经过这样处理的样品中的肽链都是处于无二硫键连接的，分离的状态。由于SDS是

6、带有负电荷的分子，同时它有一个长的疏水尾巴，SDS通过疏水尾巴与肽链中的氨基酸的疏水侧链结合，结合SDS的比率大约是一个蛋白质分子中每两个氨基酸残基结合一分子的SDS。垂直板电泳装置加样样品迁移方向电泳过程中分子迁移的规律，小分子走在前头，大分子滞后。电泳凝胶相当于凝胶过滤中的一个带孔胶粒。混合样品带孔胶按分子大小分离电泳方向电泳小分子大分子夹在两块玻璃板之间的凝胶电泳缓冲液电泳缓冲液加在槽中的经SDS处理的样品分子量小分子量大电源标准蛋白分子量未知蛋白在一定的凝胶浓度下，多肽链分子量的对数与多肽链的相对迁移率成线性关系，所以可以通过标准曲线求未知多肽链分子量。相对迁

7、移率电泳后的凝胶径考马斯亮篮染色、脱色后的凝胶照片聚丙烯酰胺凝胶电泳对分离大分子具有较高的分辨率，但核酸比蛋白质分子大得多，只能采用较大孔径的琼脂糖凝胶电泳。核酸分子本身含有大量的磷酸根，核酸带负电荷，在电场中向正极移动。溴化乙啶荧光染料对核酸染色在紫外线的照射下，发出橙红色荧光。根据荧光条带的粗细和分布的位置，可以用在对PCR扩增效果的鉴定上。说明思考凝胶层析和SDS-PAGE的原理有那些相似性谢谢二、实验操作蛋白质的提取和分离一般分为四步：1.样品处理水分固体物质血浆蛋白无机盐磷脂葡萄糖等血液血浆血细胞白细胞血小板红细胞（最多）血红蛋白（）两个α