各种印迹法的详细介绍.ppt

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1、印迹法（Blotting）技术简介李娟马晓伟oct18,2010定义：印迹法（Blotting）是指将样品转移到固相载体上，然后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。Southernblotting1975年，EdwardM.Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜（NC膜）上，并利用DNA－RNA杂交检测特定的DNA片段的方法Northernblotting1979年，McMaster和Carmichael对RNA进行印迹分析，发明Northern印迹技术Westernblotting197

2、9年，GeorgeStark对电泳后的蛋白质分子进行印迹分析从而发明western印迹技术概述生物大分子印迹法实际上是凝胶电泳技术、固定化技术及分子亲和技术三者融为一体的综合性技术，其核心在于把凝胶电泳已分离的区带转移并印迹于固定化膜上。蛋白质分析中应用的Western杂交方法与DNA分析应用中的Southern杂交法RNA分析中的Northern杂交法相似，均是把电泳分离的组分从凝胶转移到一种固相支持体上，并均以针对特定氨基酸或核苷酸序列所制备的特异性样品作为探针检测其相同或相似序列。Southern

3、BlottingDNA提取琼脂糖电泳印迹转移预杂交杂交（变性探针）洗膜放射自显影或显色NorthernBlottingRNA提取琼脂糖电泳印迹转移预杂交杂交（变性探针）洗膜放射自显影或显色WesternBlotting基本原理在电场的作用下将电泳分离的多肽从凝胶转移至膜上，然后用这种多肽的特异抗体来检测。WesternBlotting操作流程蛋白样品的制备SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳转膜封闭一抗孵育二抗孵育底物显色使用的仪器聚丙烯酰胺凝胶电泳1.聚丙烯酰胺凝胶电泳迁移率主要依据其分子量和电荷的差异及形状等因

4、素2.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳迁移率主要依赖于蛋白质大小SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳原理：☞SDS是一种阴离子表面活性剂即去污剂,它可以断开分子内和分子间的氢键,破坏蛋白质分子的二级及三级结构,并与蛋白质的疏水部分相结合,破坏其折叠结构☞SDS与蛋白质结合后使SDS-蛋白质复合物上带有大量的负电荷,平均每两个氨基酸残基结合一个SDS分子,这时各种蛋白质分子本身的电荷完全被SDS掩盖,远远超过其原来所带的电荷,从而使蛋白质原来所带的电荷可以忽略不计,消除了不同分子之间原有的电荷差别,其电泳迁移率主要取决于亚

5、基分子质量的大小,这样分离出的条带带也为蛋白质的亚基SDS-PAGE分离胶配方SDS-PAGE浓缩胶配方电泳上层浓缩胶的电泳电压要低于分离胶的电泳电压，使样品更好的进入凝胶。电泳时，应采用恒压的模式，这样蛋白质才可以保证恒定的电泳迁移率。一般采用恒压浓缩胶80V，30min分离胶110V时间视所要检测的蛋白分子量及胶浓度而定。转膜后检测丽春红染色丽春红带负电荷，可以与带正电荷的氨基酸残基结合，同时丽春红也可以与蛋白的非极性区相结合，从而形成红色的条带，丽春红对蛋白的染色是可逆的，染色后可以用PBS或TB

6、S-T溶液洗去封闭脱脂奶粉（5％）BSA（牛血清白蛋白）WesternBlotting膜封闭液洗转印膜：室温用TBS-T漂洗3次x10min,以尽量洗去转印膜上的SDS，防止影响后面的抗体结合。2)取漂洗的转印膜，放入5%No-fatmilk的封闭液内，摇床震动，室温封闭2h，也可在4度过夜。3)用1xTBS-T，PH7.6洗液，室温漂洗3次x10min.一抗、二抗孵育1.把硝酸纤维素滤膜放在密闭塑料袋或者培养皿中，根据抗体效价选择合适的抗体浓度，将一抗溶液与滤膜温育。室温6小时左右，4℃过夜2.倒掉一

7、抗溶液，用TBS-T漂洗液滤膜3次，每次7min3.加入用封闭液配制的二抗，摇床上缓慢摇动，室温2小时4.倒掉二抗溶液，用TBS-T漂洗液滤膜3次，每次7min,即可准备显影二抗与底物反应显色辣根过氧化物酶法（HRP）将在暗室中将显色剂A,B溶液按1：1混合，后均匀涂抹在膜上结合有二抗的地方即可催化底物发出荧光将胶片贴在膜的发光区上，根据荧光强弱选择合适的曝光时间曝光结束后将胶片放入显影液中至出现条带后再放入定影液中转膜：膜的选择，转膜方法取舍样品处理Westernblotting常见问题分析及其应用马

8、晓伟膜的选择转膜-膜的选择☞硝酸纤维素膜（NC膜）价格便宜，简单快速封闭与非特异性抗体结，通常有0.45µm和0.2µm两种规格的NC膜，大于20kD的蛋白可用0.45µm的膜，小于20kD的蛋白就要用0.2µm的膜了，如用0.45µm的膜就会发生“Blowthrough”的现象。☞聚偏氟乙烯膜（PVDF膜）PVDF膜灵敏度、分辨率和蛋白亲和力比常规的膜要高，对蛋白的吸附能力要远远大于NC膜,非常适合于低分子量蛋白的检测，小分子更不容易渗透