细胞冷冻保存方法.doc

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1、细胞冷冻保存方法、注意事项1、欲冷冻保存之细胞应在生长良好(logphase)且存活率高之状态，约为80–90％致密度。2、冷冻前检测细胞是否仍保有其特有性质，例如hybridoma应在冷冻保存前一至二日测试是否有抗体之产生。3、注意冷冻保护剂之品质。DMSO应为试剂级等级，无菌且无色(以0.22micronFGLPTelflon过滤或是直接购买无菌产品，如SigmaD-2650)，以5~10ml小体积分装，4oC避光保存，勿作多次解冻。Glycerol亦应为试剂级等级，以高压蒸汽灭菌后避光保存。在开启后一年内使用，因长期储存后对细胞会有毒性。

2、4、冷冻保存之细胞浓度：（1）normalhumanfibroblast:1~3x106cells/ml（2）hybridoma:1~3x106cells/ml，细胞浓度不要太高，某些hybridoma会因冷冻浓度太高而在解冻24小时后死去。（3）adherenttumorlines:5~7x106，依细胞种类而异。Adenocarcinoma解冻后须较高之浓度，而HeLa只需1-3x106cells/ml。（4）othersuspensions:5~10x106cells/ml,humanlymphocyte须至少5x106cells/ml。

3、5、冷冻保护剂浓度为5或10％DMSO，若是不确定细胞之冷冻条件，在做冷冻保存之同时，亦应作一个backupculture，以防止冷冻失败。6、冷冻方法：（1）传统方法:4oC10分钟--->-20oC30分钟--->-80oC16-18小时(或隔夜)--->液氮槽vaporphase长期储存。（2）程序降温：利用等速降温机以–1～-3oC/分钟之速度由室温降至–120oC，放在液氮槽vaporphase长期储存。适用于悬浮型细胞与hybridoma之保存。7、材料：（1）生长良好之培养细胞（2）新鲜培养基（3）DMSO(SigmaD-2650

4、)（4）无菌塑料冷冻保存管(Nalgene5000-0020)（5）0.4％w/vtrypanblue(GibcoBRL15250-061)（6）血球计数盘与盖玻片（7）等速降温机(KRYO10SeriesII)8、步骤：（1）冷冻前一日前更换半量或全量培养基，观察细胞生长情形。（2）配制冷冻保存溶液(使用前配制)：将DMSO加入新鲜培养基中，最后浓度为5-10％，混合均匀，置于室温下待用。（3）依细胞继代培养之操作，收集培养之细胞，取少量细胞悬浮液(约0.1ml)计数细胞浓度及冻前存活率。（4）离心，去除上清液，加入适量冷冻保存溶液，使细胞浓

5、度为1-5x106cells/ml，混合均匀，分装于已标示完全之冷冻保存管中，1ml/vial，并取少量细胞悬浮液作污染检测。（5）冷冻保存方法1:冷冻管置于4oC10分钟→-20oC30分钟→-80oC16～18小时(或隔夜)→液氮槽vaporphase长期储存。（6）冷冻保存方法2:冷冻管置于已设定程序之等速降温机中，再放入液氮槽中。程序为:program7:HBCELL