分子标记技术的类型原理及应用--ppt.ppt

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1、分子标记技术姓名：赵淑莉学校：吉林大学主要内容类型2原理及应用341概述致谢概述分子标记技术(MolecularMarkers)1974年,Grozdicker等人在鉴定温度敏感表型的腺病毒DNA突变体时，利用限制性内切酶酶解后得到的DNA片段的差异，首创了DNA分子标记。所谓分子标记是根据基因组DNA存在丰富的多态性而发展起来的可直接反映生物个体在DNA水平上的差异的一类新型的遗传标记,它是继形态学标记、细胞学标记、生化标记之后最为可靠的遗传标记技术。广义的分子标记是指可遗传的并可检测的DNA序列或蛋白质分子。通常所说的分子标记是指以DNA多态性为基础的遗传标记。分子

2、标记技术本质上都是以检测生物个体在基因或基因型上所产生的变异来反映基因组之间差异。类型及原理现已出现的分子标记技术有几十种，部分分子标记技术所属类型如下：建立在Southern杂交基础上的分子标记技术限制性内切酶片段长度多态性标记(RFLP)；染色体原位杂交(CISH)。以重复序列为基础的分子标记技术卫星DNA(SatelliteDNA)；小卫星DNA(MinisatelliteDNA)；简单序列重复SSR(SimpleSequenceRepeat)，即微卫星DNA。以PCR为基础的分子标记技术随机扩增多态性DNA(RAPD)；扩增片段长度多态性(AFLP)；单链构象多

3、态性(SSCP)；cDNA-扩增片段长度多态性(cDNA-AFLP)；靶位区域扩增多态性(TRAP)；序列特征化扩增区域(SCAR)；相关序列扩增多态性(SRAP)。以mRNA为基础的分子标记技术表达序列标签(ESTs)；差异显示(DD)；逆转录PCR(RT-PCR)；差异显示逆转录PCR(DDRT-PCR)；特征性差异分析(RAD)；基因表达系列分析(SAGE)。以单个核甘酸的变异为核心的分子标记技术单核苷酸多态性标记(SNP)以特定序列为核心的分子标记技术线粒体DNA分子标记(mtDNA)代表性分子标记技术的原理限制性片段长度多态性(RFLP)由Grozdicker

4、创立，并于1980年由Bostein再次提出。原理：限制性内切酶能识别并切割基因组DNA分子中特定的位点，如果因碱基的突变、插入或缺失，或者染色体结构的变化而导致生物个体或种群间该酶切位点的消失或新的酶切位点的产生。那么利用特定的限制性内切酶切割不同个体的基因组DNA，就可以得到长短、数量、种类不同的限制性DNA片段，通过电泳和Southern杂交转移到硝酸纤维素膜或尼龙膜上,选用一定的DNA标记探针与之杂交，放射自显影后就可得到反映个体特异性的DNA限制性片段多态性图谱。探针：通常是随机克隆的与被检测物具有一定同源性的单拷贝或低拷贝基因组片段或cDNA片段。其中cDN

5、A探针保守性较强，许多同科物种cDNA探针都可以作为通用探针。限制性片段长度多态性(RFLP)应用在基因突变分析、基因定位、基因诊断、个体识别、亲缘鉴定、物种分类和进化关系研究，以及组建高密度的遗传图谱和育种操作等方面都有一定的应用和重要的实用价值。限制性片段长度多态性(RFLP)限制性片段长度多态性(RFLP)优点标记广泛存在于生物体内，不受组织、环境和发育阶段的影响。RFLP标记的等位基因是共显性的，不受杂交的影响，可区分纯合基因与杂合基因。可产生的标记数目很多，可覆盖整个基因组。缺点标记技术需要酶切,对DNA质量要求高；RFLP的多态性程度偏低；分子杂交时会用到放

6、射性同位素，对人体和环境都有害；探针的制备、保存和发放也很不方便；分析程序复杂、技术难度大、费时、成本高。限制性片段长度多态性(RFLP)染色体原位杂交(CISH)染色体原位杂交在原位杂交技术中应用最广泛，它是一种基于Southern杂交的分子标记技术。原理：该技术利用特异性核酸片段作探针,直接同染色体DNA片段杂交,在染色体上显示特异DNA。染色体原位杂交(CISH)探针可采用同位素标记探针,杂交后通过放射自显影显示杂交信号,也可以采用非放射性大分子如生物素、地高辛等标记特异核酸片段,杂交信号经酶联显色或荧光显色得以显示。优点准确、直观缺点技术非常复杂简单序列重复(S

7、SR)即微卫星DNA微卫星是指以少数几个核苷酸(1~6个)为单位多次串联重复的DNA序列。微卫星由核心序列和两侧的保守侧翼序列构成。保守的侧翼序列使微卫星特异地定位于染色体某一区域，核心序列重复数的差异则形成微卫星的高度多态性。简单序列重复(SSR)原理：由于重复次数的不同及重复程度的不完全造成了每个位点的多态性。根据其两端的保守序列设计一对特异性引物，PCR扩增，再经聚丙烯酰胺凝胶电泳即可显示不同基因型个体在这个SSR位点的多态性。简单序列重复(SSR)应用是种群研究和进化生物学最常用的分子标记之一，广泛地应用于生物杂交育种、遗传连锁图