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1、应用富含血小板血浆构建组织工程骨探究［摘要］目的探究富含血小板血浆（PRP）是否能成为接种骨髓间充质干细胞（BMSCs）于3D支架中的有效媒介，是否具有促进骨组织再生、新生骨成熟及血管化的作用，为组织工程骨的构建策略及动物实验和临床应用提供理论依据。方法体外培养新西兰兔BMSCs至第三代作为种子细胞，分别应用PRP组、乏血小板血浆（PPP组）重悬BMSCs,双相接种法构建细胞/支架复合体，另设对照组，通过检测支架内DNA含量、碱性磷酸酶（ALP）含量，对比细胞的接种效率、增殖和分化情况。结果PRP组的成
2、骨量较PPP组和对照组显著（P1.5MSCs细胞的验证1.5.1成骨诱导分化及鉴定371水浴快速复苏第3代细胞，接种于6孔培养板，接种密度为1.0X104/ml,待细胞80%〜90%融合时加入成骨诱导培养基（低糖全培养基中加入甘油磷酸钠10mmol/L、L-抗坏血酸50ug/ml、地塞米松10-8mol/L）进行联合诱导培养，培养至14d后，PBS冲洗2次，95%乙醇固定10min,双蒸水冲洗3次。0.1%茜素红-Tris-HCl（pH8.3）37°C,30mino蒸馆水冲洗，干燥，封片。倒置显微镜下观
3、察染色结果。1.5.2成软骨诱导分化及鉴定细胞复苏及培养方法同上，待细胞80%〜90%融合时加入成软骨诱导培养基（低糖全培养基中加入L-抗坏血酸50Pg/mR地塞米松10~8mol/L.TGF-P110ug/L）,培养至14d后，用10%甲醛固定lh,自来水冲15min,蒸馆水洗一次，1%甲苯胺蓝染2〜4h。加入95%乙醇，洗去多余的染液，倒置显微镜下观察。1.5.3成脂诱导分化及鉴定细胞复苏及培养方法同上，待细胞80%〜90%融合时加入成脂诱导培养基（低糖全培养基中加入0.25umol/L地塞米松,5
4、0umol/L噪美辛，0.5mmol/LIBMX,10mg/L牛胰岛素），诱导2周后，细胞经PBS洗涤，10%甲醛固定30min,稀释油红储存液，油红：去离子水二3:2,滤纸过滤，室温放置10min,染色10min左右。脱色，复染，甘油明胶封片。倒置显微镜观察。1.6细胞/支架复合体构建1.6.1PRP和PPP的制备配置抗凝剂ACD：0.48g枸椽酸，1.32g枸椽酸钠，1.47g葡萄糖溶于100ml双蒸水中，0.45um过滤消毒，冷藏备用。于一只新西兰白兔心脏抽取全血40ml,其中加入40mlACD,
5、摇匀，移入50ml离心管，1000r/min离心15min。取上层血浆，弃红细胞，二次离心，3000r/min离心20mino上层为清亮的PPP,移入另一个15ml离心管中备用。中间层为白色的血小板，轻轻用吸管搅动吸出移至另一离心管中，下层红细胞弃之。用少量PPP将血小板重悬，人工血小板计数，调节成浓度为106/U1的PRP备用o1.6.2支架的预处理3D-PLGA支架规格为100mmX30mmX3nun,PLA:PGA=75:25O空隙率为85%〜90%,孔径大小100〜300umo用11号尖刀片将大
6、块PLGA切成长宽均为10mm,厚3mm的立方体。将3D-PLGA小块浸泡于75%乙醇中24h,PBS缓冲液反复漂洗3次，然后将其多余水分吸干，经预湿处理后，再滴加细胞悬液，以增加支架的亲水性。1.6.3构建细胞/支架复合体将上述支架分3组，分别为PRP、PPP、空白对照组，每组8个样本。将第三代种子细胞MSCs低速离心后，PRP组采用成骨诱导培养基加PRP溶液重悬细胞，PPP组采用成骨诱导培养基加PPP溶液重悬细胞,空白对照组单纯采用成骨诱导培养基重悬细胞。运用细胞计数法调整细胞密度至5.0X107/
7、ml,制成高密度细胞悬液。用微量移液枪吸取细胞悬液缓缓滴加于支架材料上，随即滴加0.05ml凝血酶溶液（10000U凝血酶加入10%CaC12中）,做到不使细胞溢出，移入六孔板中，每孔5ml诱导培养基,放置孵箱中，37°C,5%C02,孵育1h后，再次滴加细胞悬液于支架上，形成二次沉淀，以提高接种数量。接种后48h倒置显微镜下观察。第3天半量换液，以后每隔2〜3d全量换液。1.7细胞/支架复合体DNA定量分析培养至第15天时，PBS缓冲液漂洗细胞/支架复合体2次，放入15ml离心管中，剪成小块，加1ml
8、骨细胞消化液，37°C水浴2ho将消化混合液吸入15ml离心管，超声细胞破碎机处理5次，6s/次，共30s,离心200r,5min,取上清液待用。上清液50U1置于48孔黑色不透光酶标板内,每个样本2个副孔，每孔加150ulHoechst33258测试液(1mg/ml),放入荧光酶标仪样品槽，震荡混匀30s,选择激发波长360nm,发射波长460nm,以小牛胸腺DNA作标准曲线，测定样品的荧光强度。1.8细胞/支架复合体ALP活性定量分析取
