高效液相色谱仪的使用保养及常见问题解决方法.docx

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1、高效液相色谱仪的使用保养及常见问题解决方法一.HPLC的正确使用1、保持贮液瓶清洁，对专用贮液瓶应定期清洗；用试剂瓶作贮液瓶时，要经常更换。2、定期在稀硝酸溶液中超声、清洗过滤器，保持过滤器畅通无阻。（溶剂过滤器）3、使用HPLC试剂和新蒸二次蒸馏水作流动相，所使用的溶剂其截止波长一定要低于检测波长，对不是HPLC级的试剂要进行过滤（HPLC试剂出厂前已用0.02μm滤膜过滤）。对流动相一定要脱气常用的脱气方法有：加热煮沸、抽真空、超声、吹氦等。对混合溶剂，若采用抽气或煮沸法，则需要考虑低沸点溶剂挥发造成的组成变化。超声脱气比较好，10~20分钟的超声处理对许多有机溶剂或有机溶剂/水混合

2、液的脱气是足够了（一般500ml溶液需超声20~30min方可），此法不影响溶剂组成。超声时应注意避免溶剂瓶与超声槽底部或壁接触，以免玻璃瓶破裂，容器内液面不要高出水面太多。离线（系统外）脱气法不能维持溶剂的脱气状态，在你停止脱气后，气体立即开始回到溶剂中。在1~4小时内，溶剂又将被环境气体所饱和。4、每天开始使用仪器，注意放空排气，确保泵头、流动池以及其它流路系统中无气泡存在。5、珍惜保护色谱柱，避免柱头突然产生大的波动，扰动损伤柱床。如避免泵启动过速、升压过快、样品阀搬动过慢所造成的柱压大的波动。6、采用保护柱，延长柱寿命。如污染物堆积于保护柱柱头，造成柱压升高，柱效下降，峰形变差时

3、，卸下用强溶剂反冲后再用或更换新保护柱。7、避免超负荷进样，对250×4.6mm的柱子,绝对进样量应不超过100μg。在灵敏度允许的前提下，应尽量将试样浓度降低，减少绝对进样量（进样体积可保持不变），这是保持HPLC柱性能持久良好的重要举措之一。8、经常用强溶剂冲洗柱子，将柱内强保留组分及时洗脱出。反相柱用异丙醇--二氯甲烷（1：1）冲洗，及时用适当溶剂冲洗柱子和进样阀，尤其是对过夜的柱子和进样阀，一定要用足量的水彻底洗净其中的盐类、缓冲液，再用甲醇或乙腈冲洗，并保存在乙腈中。正相柱保存在非极性有机溶剂（如己烷）中。10、以硅胶为基质的柱子，如C-18、C-8等，要控制好流动相的pH值，

4、一般不要低于2.5，不高于7.0。11、尽量用流动相溶解样品，一是避免出现拖尾峰、怪峰，二是避免试样在系统中由于溶解度降低而析出。14、用HPLC分析酸碱性物质，由于吸附作用（次级保留）使峰形拖尾。加入改良剂可以大大改善峰形，提高积分的准确度。一般规则是：（1）分析酸性物质，可加入1%有醋酸。（2）分析碱性物质，可加入10-20mmol/L三乙胺。（3）酸碱物质混为一体，可同时加入1%的醋酸和10-20mmol/L三乙胺二.常见问题解决方法1针对柱压问题（表1）柱压问题是使用高效液相色谱过程中需要密切注意的地方，柱压的稳定与色谱图峰形的好坏、柱效、分离效果及保留时间等密切相关。所谓柱压稳

5、定并不是指压力值稳定于一个恒定值，而是指压力在波动范围。柱压不稳定，原因可能有：p>vPMV7<   a有空气，解决的办法是清除泵内空气，对溶剂进行脱气处理；$0X{yv9   b比例阀失效，更换比例阀即可。u[1]@c7$!0   c泵密封垫损坏，更换密封垫即可。D[;ho"&   d溶剂中的气泡，解决的办法是对溶剂脱气，必要时改变脱气方法；D94aRXh   e系统检漏，找出漏点，密封即可。{QXXCS   f梯度洗脱，这时压力波动是正常的。但是在使用梯度洗脱时，进柱压的平稳缓慢的变化是允许的。2针对异常色谱峰问题异常的色谱峰指的是色谱图中无峰或出现负峰、宽峰、双峰、肩峰、峰形不

6、对称等情况。3高效液相色谱仪的保养3．1HPLC的日常操作条件工作温度10～30℃；相对湿度<80％；最好是恒温、恒湿，远离高电干扰、高振动设备。3．2泵的保养使用流动相尽量要清洁；进液处的沙芯过滤头要经常清洗；流动相交换时要防止沉淀；避免泵内堵塞或有气泡。3．3进样器的保养每次分析结束后，要反复冲洗进样口，防止样品的交叉污染。3．4柱的保养柱子在任何情况下不能碰撞、弯曲或强烈震动；当柱子和色谱仪连接时，阀件或管路一定要清洗干净；要注意流动相的脱气；避免使用高粘度的溶剂作为流动相；进样样品要提纯；严格控制进样量；每天分析工作结束后，要清洗进样阀中残留的样品；每天分析测定结束后，都要用适当

7、的溶剂来清洗柱；若分析柱长期不使用，应用适当有机溶剂保存并封闭。正确使用缓冲盐:正确使用缓冲盐的目的是防止缓冲盐的析出，可归结为一句话:使用前要过渡，使用后要冲洗。具体方法为：使用缓冲盐前要用过渡流动相以1.0mL/min的流速冲洗20-30倍的柱体积，然后再使用含有缓冲盐的流动相；使用后除去的方法为用过渡流动相以1.0mL/min流速冲洗30倍柱体积，然后以纯有机溶剂冲洗30倍柱体积保存。过渡流动相是指有机相和水相组成与分析流动相