环境微生物学 教学课件 作者 殷士学 第10章.ppt

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1、第10章10.1　基于生物化学的微生物生态学研究方法10.2　基于染色的微生物生态学研究方法10.3　基于核酸的微生物生态学研究方法10.4　稳定性同位素探针10.1　基于生物化学的微生物生态学研究方法10.1.1　平板培养及其改进10.1.2　群落水平上的碳源利用类型10.1.3　磷脂脂肪酸剖面类型分析(PhospholipidFattyAcidAnalysis,PLFA)10.1.1　平板培养及其改进1.平板培养(Plate2.提高微生物可培养性的方法改进1.平板培养(Plate图10-1　平板计数方法2.提高微生物可培养性的方法改进图10-2　胶微滴

2、方法流程及其主要结果(引自Bruns等，2003)a)胶微滴方法流程　b)试验结果a—游离活细胞　b—含单细胞微粒　c—含微菌落微粒　d～f—含有微菌落的微粒相差显微照片10.1.2　群落水平上的碳源利用类型表格10.1.2　群落水平上的碳源利用类型图10-4　不同环境样品的CLPP(每条曲线代表一种环境样品)10.1.3　磷脂脂肪酸剖面类型分析(PhospholipidFattyAcidAnalysis,PLFA)表10-1　不同微生物的标记脂肪酸10.1.3　磷脂脂肪酸剖面类型分析(PhospholipidFattyAcidAnalysis,PLFA)

3、图10-5　磷酸脂肪酸组成分析程序10.2　基于染色的微生物生态学研究方法10.2.1　荧光染色剂方法10.2.2　其他方法10.2.1　荧光染色剂方法表10-2　常用的荧光染色剂10.2.1　荧光染色剂方法图10-6　环境样品中微生物染色照片a)土壤颗粒表面原有微生物的溴乙非啶染色照片(引自Li等，2003)　b)土壤接入大肠杆菌后溴乙非啶染色照片(引自Li等，2003)　c)活性污泥DAPI染色照片，箭头所指为球菌(Wong等，2005)10.2.1　荧光染色剂方法图10-7　用LIVE/DEAD染色照片10.2.1　荧光染色剂方法1008.TIF10

4、.2.2　其他方法利用抗原-抗体之间的高度专一性，用适当的制备方法可使抗体带有荧光成分，这样就可以检测环境样品中某一种具体的微生物。早在20世纪60年代该方法就用于环境样品中微生物的检测，现在依然有人使用，效果非常好，只是抗体制备非常费时。10.3　基于核酸的微生物生态学研究方法10.3.1　环境样品中总DNA的提取10.3.2　(G+C)摩尔分数法10.3.3　DNA复性方法10.3.4　核酸杂交技术10.3.5　DNA标记序列扩增10.3.6　基于PCR的微生物群落结构分析技术10.3.1　环境样品中总DNA的提取1.环境样品的采集与处理2.细胞裂解3

5、.去除蛋白和细胞碎片4.DNA沉淀5.DNA纯化6.提取方法和DNA质量评价10.3.1　环境样品中总DNA的提取图10-9　DNA提取步骤1.环境样品的采集与处理与从纯菌株中提取DNA不同，环境样品中含有大量复杂的有机和无机颗粒，既影响DNA的提取效率，也影响DNA的纯度。DNA提取效率的高低影响到最后结果是否反映环境样品中的实际情况；DNA的纯度影响是否可以进一步扩增。2.细胞裂解根据提取DNA前是否分离细胞，方法大体上分两种，即原位提取法和外位提取法。原位提取法是不用分离到菌体细胞而是直接把细胞裂解以提取DNA的方法，这种方法也称为直接提取法。外位提

6、取法是首先从土壤中分离到菌体细胞，然后再把细胞裂解以提取DNA的方法，亦称为间接提取法。原位提取法获得DNA的量较多，但其中的杂质较多；外位提取法提取到的DNA量要少得多，这是因为菌体细胞与土壤颗粒粘附较牢，不易分开，因此，靶微生物丢失较多，但分离到的DNA纯度较高。3.去除蛋白和细胞碎片一般用苯酚和氯仿使蛋白质变性，离心后变性蛋白质停留在有机相与水相的交界面，DNA溶解在水相中，从而将蛋白与DNA分开。4.DNA沉淀DNA在乙醇、异丙醇、聚乙二醇等溶剂中都能沉淀。但是，环境样品中一般含有腐殖质，所以应该尽量选择少沉淀腐殖质多沉淀DNA的沉淀剂。相比之下，

7、异丙醇可以得到高产量的DNA且不会增加腐殖酸的污染，是首选的沉淀剂。5.DNA纯化沉淀后的DNA通常还会含有腐殖酸和酚类化合物等杂质，这些杂质会降低DNA/DNA杂交的效率与限制性内切酶的活性，还会通过鳌合镁离子而降低Taq酶的活性，所以必须纯化DNA。目前纯化DNA的主要方法有氯化铯梯度离心法、色谱法、电泳回收法、过柱纯化法等。这些纯化方法一般都能得到良好效果。6.提取方法和DNA质量评价目前对从环境样品中提取和纯化DNA方法的评价指标主要有：细胞的裂解效率、DNA得率、DNA纯度和DNA片段的大小。由于环境样品是具有比较复杂的组成成分，同样的方法应用到

8、不同性质的土壤，DNA的得率和纯度都会有很大的差异，因此要想成功地