细胞培养技术 教学课件 作者 兰容 周珍辉 主编 章静波 主审 实验部分6乳鼠肺细胞的原代培养.ppt

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1、实验六乳鼠肺细胞的原代培养组织块培养法一、实验目的1．学习和掌握组织块培养法培养细胞的基本方法和操作过程。2．进一步掌握动物细胞培养过程中的无菌技术。3．掌握在倒置相差显微镜下观察培养细胞的形态和生长状况。二、实验原理组织切成0.5-1mm的小块后，由于组织块体积很小，在不加任何粘着剂的情况下，它们也能直接贴附于瓶壁上，然后细胞从组织块边缘向外长出生长晕，最后连接成片而形成单层细胞。此方法程序简化，是常用的原代细胞培养方法。三、器材超净工作台二氧化碳培养箱普通显微镜倒置显微镜酒精灯吸管培养瓶解剖剪眼科剪烧杯镊子（尖

2、头、圆头和弯头）四、试剂和材料Hanks液75％酒精RPMI－1640培养液(含小牛血清及青、链霉素)新生乳鼠（小鼠）五、操作（一）取材1、取新生乳鼠一只。2、采用颈椎脱臼法处死，然后把这个小鼠浸入盛有75%酒精的烧杯中2-3秒（默数5下）。3、随即携入超净工作台内，小鼠仰位放置到灭菌的培养皿中。4、用75％酒精消毒胸廓部位皮肤。5、打开消毒器械包，在胸廓正中线位处，用眼科弯镊夹起乳鼠胸部皮肤（多夹些）,用解剖剪开适当位点后,用两把眼科弯镊向左右两侧撕拉，皮肤外翻固定，充分暴露躯干部肌肉（注意：不要使表皮面接触到已

3、暴露出来的胸腹肌）。酒精消毒乳鼠胸廓后，换一套金属器械，沿着隔膜剪断胸廓，并将胸骨两侧肋骨剪断。胸廓暴露后，可见跳到的心脏和粉红色的肺。换一把弯头眼科镊，将弯头向下，从心脏右上方插入心肺连接处，轻轻向上用力，将心肺一齐取出，放置在灭菌的培养皿中，用镊子去除心脏，肺移入已加Hanks液的青霉素瓶内。（二）漂洗用Hanks液清洗肺脏表面血污，然后用眼科直剪粗剪几下，再用Hanks液漂洗多次，去净血污，将洗净的组织块置青霉素小瓶一角，然后将有组织块的瓶面翻向上方，吸去流向对侧的多余液体。（三）剪切用眼科直剪将洗净的组织块

4、反复剪成0.5-1立方毫米的小块，此过程需20～30分钟（剪切时为保持组织湿润，可向组织块滴加1～2滴培养液）。然后用吸管滴加几滴培养液，轻轻吹打混匀。（四）接种和培养用润湿的吸管分次吸取小碎块悬液，注意吸在吸管前端部，以免吸得过高，使组织小块粘附于管壁而丢失。将组织碎块在培养瓶底部均匀放置（块距0.3cm大小），25毫升培养瓶放20～30块为宜。然后轻轻翻转培养瓶，加入适量培养液(液层厚约15mm)盖好，标记好，置37℃孵箱中培养4-24小时。待组织小块略干燥，能牢固贴在瓶壁时，再慢慢翻转培养瓶，使培养液浸泡组织

5、块，静置培养。操作过程中动作一定要轻，减少振动，否则会使组织块脱落，影响贴壁培养。（五）观察静置培养3天后开始在显微镜下观察细胞生长情况。注意观察培养组织小块边缘是否长出新细胞。一般最先出现的是形态不规则的游走细胞,接着是成纤维细胞或上皮细胞。当细胞分裂，细胞数量增多时，在组织块周围可见到生长晕。随后细胞生长分裂增快，呈放射状向外扩展逐渐连成一片。注意检查有否污染。可根据培养液颜色，更换培养液。约10-15天后细胞可长成单层，即可传代培养。