生化分离技术 教学课件 作者 于文国 卞进发 主编 乔德阳 主审第七章_层析技术.ppt

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1、第七章层析技术第一节层析的基本原理及分类第二节凝胶过滤层析第三节离子交换层析第四节疏水性相互作用层析第五节亲和层析第六节反相层析学习目标了解层析方法的分类及各种层析方法的应用特点；掌握层析的基本原理及各种层析方法的原理及操作；能利用各种层析技术对生物物质进行分离纯化。第一节层析的基本原理及分类一、层析的基本原理层析是根据混合物中溶质在互不混溶的两相之间分配行为的差别，引起移动速度的不同而进行分离的方法。典型的柱层析分离设备示于图7-1中。图7-1柱层析分离设备1．分离理论基础互不混溶的两相分别称为固定相(

2、stationaryphase)和流动相(mobilephase)。固定相填充于柱中，在柱的顶端(入口)加入一定量的料液后，连续输入流动相，料液中的溶质在流动相和固定相之间发生扩散传质，产生分配平衡。由于各组分在固定相中的分配系数（或溶解、吸附、交换、渗透或亲和能力）的差异，使各组分随流动相移动的速率不同，分配系数大的溶质在固定相上存在的几率大，随流动相移动的速度小。因此当流动相移动一定柱长后，使各组分在层析柱内分层，从而达到各组分分离的目的。在层析柱出口处各个溶质的浓度变化如下图7-2所示。图7-2层析

3、柱出口处各个溶质的浓度变化在定温定压条件下，当色谱分离过程达到平衡状态时，某种组分在固定相S和流动相m中含量（浓度）C的比值，称为平衡系数K（也可以是分配系数、吸附系数、选择性系数等）。其表达通式可写为：（7-1）式中K——平衡系数（分配系数、吸附系数、选择性系数等）；Cs——固定相中的浓度；Cm——流动相中的浓度。平衡系数K主要与下列因素有关：①被分离物质本身的性质；②固定相和流动相的性质；③色谱柱的操作温度。一般情况下，温度与平衡系数成反比，各组分平衡系数K的差异程度决定了色谱分离的效果，K值差异越大

4、，色谱分离效果越理想。2．阻滞因数或比移值Rf在色谱柱（纸、板）中，溶质的移动速度与流动相的移动速度之比，称为阻滞因数或比移值Rf，其定义式可写为：令As为固定相平均截面积，Am为流动相平均截面积，则系统或柱的总截面积At=As+Am。设体积为V的流动相流过色谱系统，流速很慢，可以认为溶质在两相间平衡，则：流动相移动距离=V/Am由阻滞因数的定义式可得：因此，当Am、As一定时（与装柱时的紧密程度有关），一定的平衡系数K有相应的Rf值。3．色谱图及基本概念混合液中各组分经色谱柱分离后，随流动相依次流出色谱

5、柱进入检测器，检测器的响应信号—时间曲线或检测器的响应信号—流动相体积曲线，称为色谱流出曲线，又称色谱图，如图7-3所示。色谱图的纵坐标为检测器的响应信号；横坐标为时间t，也可用流动相体积V或距离L表示。（1）基线在操作条件下，色谱柱出口处没有组分流出，仅有纯流动相流过检测器，此时的流出曲线称为基线，如图7-3中OC曲线。使基线发生细小波动的现象称为噪音，如图7-3中的空气峰。基线反映了操作条件下，检测器系统噪声随时间变化的波动情况，稳定的基线应是一条平行于横坐标的直线。图7-3色谱图（2）色谱峰当样品中

6、的组分随流动相流入检测器时，检测器的响应信号大小随时间变化所形成的峰形曲线称为色谱峰，峰的起点和终点的连接直线称为峰底。（3）峰形正常的色谱流出曲线为对称于峰尖的正态分布曲线，如图7-4(a)所示。但实际上，流出曲线并非完全对称，不正常的色谱峰有拖尾峰和前伸峰，如图7-4(b)、(c)所示。(a)(b)(c)图7-4峰形示意图（4）保留值表示混合物中各组分在色谱柱中停留时间或将组分带出色谱柱所需流动相体积的数值，称为保留值。保留值可作为定性分析的参数，由于计量单位的不同，分别称为保留时间、保留体积。①保留

7、时间tR从开始进样至柱出口处被测组分出现浓度最大值时所需的时间，称为保留时间，如图7-3所示。②保留体积VR从开始进样到柱出口处被测组分出现浓度最大值时所通过的流动相体积，称为保留体积。③死时间t0不被固定相滞留的组分（气相色谱中如空气、甲烷等），从开始进样到柱出口处出现浓度最大值时所需的时间称为死时间，其值等于流动相流经色谱柱的时间，如图7-3所示。④死体积V0不被固定相滞留的组分，从进样到出现最大峰值所需流动相的体积，称为死体积。它可由死时间t0与色谱柱出口处流动相的体积流速Fc来计算，即V0=t0F

8、c。⑤校正保留时间tR′扣除死时间后的保留时间称为校正保留时间（或调整保留时间），如图7-3所示；校正保留时间可理解为组分在固定相中实际滞留的时间。其定义式为：tR′=tR-t0⑥校正保留体积VR′扣除死体积后的保留体积称为校正保留体积（或调整保留体积）；其定义式为：VR′=VR–V0VR′与tR′之间的关系为：VR′=tR′Fc死体积V0反映了色谱柱的几何特性，它与被测物质的性质无关。保留体积VR中扣除死体积V0后，即校正保