生命科学进展.ppt

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1、生命科学进展罗晓霞中心法则生命现象的研究逐渐由获取基因序列信息转向研究基因功能，基因功能的具体体现者就是蛋白质。前言：蛋白质相互作用蛋白质可以通过某种方式与蛋白质，核酸或其他分子之间发生相互作用而形成一定形态的蛋白复合物。多亚基蛋白复合体酶-底物抗原-抗体研究蛋白质相互作用的重要意义绝大多数疾病都是由特定蛋白质相互作用所致。对200种蛋白质及2000种组合结构进行解析后，发现其中三分之一的蛋白质相互组合会导致疾病；容易导致疾病的蛋白质和其它蛋白质结合以后也将变得十分活跃，致使发病和病情恶化。蛋白质相互作用和识别在诸如DNA的复制与

2、转录、蛋白质的合成与分泌，生物催化、物质转运、新陈代谢、信号传导、免疫、细胞调控等多种重要的生命过程起着重要的作用。蛋白质之间相互作用以及通过相互作用而形成的蛋白复合物是细胞各种基本功能的主要完成者。每一种蛋白质不是孤立存在于细胞中，而是与其它蛋白质或核酸或其他小分子一起进行相互作用来行使其功能，从而使得细胞中所有蛋白质形成一个相互作用的网络，同时功能相同和相似的蛋白质在一起组成相关的功能模块，以完成相关的生理功能。蛋白质相互作用网络蛋白质相互作用的检测和分析方法一，酵母双杂交系统，YeastTwo-HybridSystem；二，

3、噬菌体表面展示技术，PhageDisplay；1.谷胱苷肽-S-转移酶沉淀，GST-pulldown；三，基于亲和层析的蛋白质相互作用研究平台2.免疫共沉淀，Co-immunoprecipitation；3.亲和印迹，Ligandblot。一，酵母双杂交系统YeastTwo-HybridSystem1989年Field和Song等人在酵母细胞中设计的分析蛋白质相互作用的方法，以真核细胞转录激活因子的结构和活性特点为基础的。Stelzl等(2005)和Raul等(2005)则先后分析了人脑组织、人已知ORF中大规模的蛋白质相互作用网

4、络。Rain等(2001)用该法绘制了人类胃肠道病原菌Helicobacterpylori的大规模蛋白质相互作用图谱。随后，Giot等(2003)和Li等(2004)在果蝇和线虫中也成功地研究了大规模的蛋白质相互作用。酵母激活因子GAL4：N端：147个氨基酸组成的DNA结合域(DNAbindingdomain,BD)，C端：113个氨基酸组成的转录激活域(transcriptionactivationdomain,AD)。GAL4分子的DNA结合域可以和上游激活序列(upstreamactivatingsequence，UAS)

5、结合，而转录激活域则能激活UAS下游的基因进行转录。组成部分：（1）与BD融合的蛋白表达载体，被表达的蛋白称诱饵蛋白（bait）；（2）与AD融合的蛋白表达载体，被其表达的蛋白称靶蛋白（prey）；（3）带由一个或多个报告基因的宿主菌株。酵母双杂交系统工作原理酵母双杂交实验流程酵母双杂交系统的应用范围检测已知蛋白质之间的相互作用；确定蛋白质相互作用功能区域位点；筛选与靶蛋白发生相互作用的未知蛋白。不需分离和标记靶蛋白，采用高拷贝和强启动子的表达载体使杂合蛋白过量表达，避免蛋白质纯化过程；检测在活细胞内进行，真实反应体内蛋白质间相互

6、作用情况；敏感度高，可检测存在于蛋白质之间的微弱的或暂时的相互作用；可进行高通量筛选；成本低，无需特殊的检测设备。基因型和表型相联系，可直接得到相互作用蛋白的编码序列。酵母双杂交系统的优点限于检测定位于细胞核内的蛋白质间相互作用；假阳性：本身具有激活转录功能的蛋白；cDNA反向插入；融合蛋白可能会影响蛋白的真实结构和功能。蛋白质与蛋白质酵母双杂交系统的局限性二，噬菌体表面展示技术PhageDisplay噬菌体：感染细菌、真菌、放线菌或螺旋体等微生物的病毒。1985年Smith—证实噬菌体fd基因组能通过基因工程的手段进行改造。19

7、88年Parmley—将已知抗原决定簇与噬菌体PⅢN端融合呈现在其表面。1990年McCafferty—用噬菌体展示技术筛选溶菌酶的单链抗体成功使噬菌体展示技术进入一个广泛应用的时代。一系列噬菌体文库的构建—噬菌体展示技术焕发出了新的生命力。噬菌体展示技术的发展简史利用固相支持物上的抗体或受体，采用亲和筛选法从噬菌体文库中筛选出能结合筛选分子的目的噬菌体。在噬菌体pIII和pⅧ衣壳蛋白N端插入外源待筛基因编码的蛋白或cDNA文库，形成的融合蛋白表达在噬菌体颗粒的表面；外源多肽或蛋白质表达在噬菌体的表面，其编码基因可通过分泌型噬菌体

8、的单链DNA测序推导出来。噬菌体表面展示技术原理噬菌体表面展示操作流程构建cDNA文库，使外源基因与外壳蛋白基因融合，导入噬菌体DisplayBindtoantigenWashtoremoveunboundphageEluteAmplifyAnal