流感病毒实验室检测.ppt

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1、流感病毒实验室检测技术及盲样考核结果分析湖南省疾病预防控制中心微生物检验科黄一伟2013-12-27流感监测目的（一）监测流感活动水平和流行动态；（二）及时发现流感病毒变异并作出预警；（三）为全球及我国流感疫苗毒株的预测和推荐提供依据。流感监测内容（一）流感样病例监测（二）流感样病例暴发疫情监测流感样病例监测标本采集采集对象：流感样病例发热（体温≥38℃），伴咳嗽或咽痛之一者采集时间：病人发病的头3天内采集采集地点：国家级流感样病例监测哨点医院采集数量：根据就诊ILI病例数的多少，每家哨点医院每周至少采集5～15份流感样病例的标本(根据流行季节、流行强

2、度、防控工作需要实时调整）暴发疫情标本采集（1）1周内，在同一学校、幼儿园或其他集体单位发生30例及以上流感样病例；或发生5例及以上因流感样症状住院病例（不包括门诊留观病例）；或发生2例及以上有流行病学关联的死亡病例；（2）在某一社区内（如同一乡或街道）1周内出现流感样病例异常增多。每一起暴发疫情一般应当采集10份左右咽、鼻拭子标本（如果现症病例在10例以下的，应当尽量全部采样）。采集标本类型常规特殊咽拭子鼻咽/呼吸道吸取物鼻拭子鼻洗液痰液　　　　呼吸道灌洗液肺组织活检标本尸检标本采样液常用的采样液有：PH7.4-7.6的Hank’s液或MEM；标本采

3、集后应立即放入适当的采样液中低温保存，同时加入抗菌素（入庆大霉素50mg/mL，多粘菌素B250μg/mL）咽拭子采集咽拭子用灭菌棉签（最好用聚丙烯纤维头的塑料杆拭子）擦拭双侧咽扁桃体及咽后壁，将棉签头部浸入含3-4ml采集液的管中，尾部弃去，旋紧管盖。标本的保存与运送标本采集后应在4℃条件下，尽快（哨点监测48小时疫情24小时内）运送至流感监测网络实验室未能送至实验室的，应置-70℃或以下保存，一周内送实验室冻存的标本，尽量避免其反复冻融，在冷藏条件下送到实验室实验室生物安全要求季节性流感病毒分离鉴定在生物安全Ⅱ级实验室进行。流感病毒分离鉴定及其它检

4、测过程中所有能够产生感染性气溶胶的过程必须在生物安全Ⅱ级实验室的生物安全柜里操作。用灭活的抗原进行血清学检测时可以在生物安全Ⅰ级实验室进行标本的接收接收标本时必须核对送检表流感监测网络实验室的工作人员接到标本后，24小时内将“流感/人禽流感监测病例标本原始登记送检表”（表2）录入到“监测信息系统”标本的处理标本送至实验室后，立即进行处理，未加抗菌素的加入适量的抗菌素。将原始标本一分为三份，一份（1ml）用于MDCK细胞接种，一份（1ml）用于鸡胚接种，一份（1ml）保存待复核。（根据检测程序实时调整）实验室检测◆核酸检测◆病毒分离和鉴定：鸡胚分离和细胞

5、培养◆胶体金快速检测检测流程临床标本采集接种MDCK细胞接种鸡胚红细胞凝集抑制试验，鉴定病毒红细胞凝集试验寄送国家流感中心流感病毒核酸检测阳性核酸检测核酸提取-QIAamp®ViralRNAMiniKit1）在1.5ml离心管中加入AVL（病毒裂解液）560ul。2）取采样液（鼻拭子、咽拭子、胸水等）或病毒培养物（鸡胚尿囊液或细胞培养液）140ul加入上述离心管中（粪便标本用10％悬液的上清），震荡15s，室温放置10min。3）稍离心后，加入560ul无水乙醇，震荡15s。4）将ViralRNAMinispin柱子取出，将步骤3的混合液吸取630ul

6、加入柱子中，8000rpm离心1min。弃离心液。5）重复步骤4。6）将吸附柱放入一新的2ml套管中，加入500ulAWl液，8000rpm离心1min。弃套管及其离心液。7）将吸附柱放入一新的2ml套管中，加入500ulAW2液，13000rpm离心3min，弃套管及其离心液。8）将吸附柱放入一新的1.5ml离心管中，于柱中加入60ul的AVE液，室温静置1－3分钟，8000rpm离心1min，收集离心液即为提取的病毒RNA，立即实验或－20℃以下保存。荧光定量PCR第一次使用前引物稀释1．引物工作浓度（40μM）配制方法：（1）将新合成的引物开盖前

7、短暂离心（12000rpm，15s）。（2）用RNaseFreeWater溶解，加水量为10×总摩尔数，充分混匀，此时引物浓度为100μM，可作为储存液。（例如：假设合成引物每管2OD，若2OD的量为9.1nmol，加水量为10×9.1＝91μl）（3）将100μM的引物2.5倍稀释，此时浓度为40μM，可作为工作浓度。2．探针工作浓度（10/20μM/）配制方法：（1）将新合成的探针管开盖前短暂离心（12000rpm，15s）。（2）用RNaseFreeWater溶解，加水量为10×总摩尔数，充分混匀，此时引物浓度为100μM，可作为储存液。（3）将

8、100μM的探针10/5倍稀释，此时浓度为10/20μM，可作为工作浓度。荧光定量PCR引物和