源自产碱杆菌DN25降氰酶催化功能的研究.pdf

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3、Ｎ２５降氛酶催化功能的研究尹业兴学科专业环境工結指导教师刘幽燕教授论文答辩日期２０１６年５月２７日学位授予日期答辩委员会主席廖丹葵教授广西大学学位论文原创性和使用授权声明本人声明所呈交的论文，是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的研究成果。除已特别加Ｗ标注和致谢的地方外，论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写的研究成果，也不包含本人或他人一为获得广西大学或其它单位的学位而使用过的材料。与我同工作的同事对本论文的研究工作所做的贡献均已在论文中作了明确说明。本人在导师指导下所完成的学位论文及相关的职

4、务作品，知识产权归属广西大学，。本人授权广西大学拥有学位论文的部分使用权即：学校有权保存并向国家有关部口或机构送交学位论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅，可Ｗ将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索和传播，可Ｗ采用影印、缩印或其它复制手段保存、汇编学位论文。本学位论文属于；□保密，在年解密后适用授权。囚不保密。＂”（请在上相应方框内打Ｖ）论文作者签名：：＾分若曰親ｔ指导教师签名：务，曰期：户攀作者联系电话：电子邮箱：源自产巧杆菌ＤＮ２５的降氨酪催化功能的研究摘要氯水解酶和氧水合

5、酶属于腊超家族酶，二者均能有效水解氨化氨，但），来是产物不同（前者为甲酸和氨，后者为甲醜胺目前已发现的两种酶均源不同菌株。本课题组在前期研究中从菌株皆ｅ？ｅｓｓｐ．ＤＮ２５中克隆并一纯化出概降解酶（命名为ｃｄＥ），水解产物中同时包含甲酸、氨和甲醜腔。本论文因此对ｃｄＥ所表现出来的双功能催化作用进行探讨。９７％的ｃｄＥ，确定其水解首先，采用梯度洗脱纯化的方法获得了纯度为°反应最佳Ｈ和温度分别为７和３０Ｃ，纯酶水解觀化钟的两种产物（甲酸ｐ和甲醜胺）的相对含量会受到ｐＨ和温度的影响。无组氨酸标签ＣｄＥ水解实验结果证明了组氨酸标签对ｃｄ

6、Ｅ的催化特性无影响。由此认为ＣｄＥ既具有氧水解酶的功能也有氨水合酶的功能。Ｃ化氨基酸序列与源自’５化反ｍＡＫ６１的氯水解酶的相似度为９９％，经突变实验对比分析，认为两者催化功能的差异不是由于基因突变引起的。－Ｇ－提出Ｃ祀的催化机理为：底物与催化Ｈ联体Ｃｓｌ６３ｌｕ４７Ｌｙｓｌ２９形成ｙ的中间体可同时１＾途径Ａ（表现为氛水解酶功能）和途径Ｂ（表现为氨水合酶功能）完成水解反应，且途径Ａ和途径Ｂ在概水解过程中具有选择性。一进步同源建模和分子对接技术为手段，通过定点突变手段筛选到几个对ｃｄＥ的催化功能起到重要作用的突变体。这些突变体

7、中除了Ｔｒｌ６４Ａｌａ、ｐＭｅｔｌ６２Ｈｉｓ和Ｇ山１３６Ａｌａ利于甲醜胺的生成，Ｈ个突变体水解产物中甲醜胺、１６倍Ｍｅｔｌ６２Ａｌａ５．５倍．２４倍和１．７，其余突变体（和甲酸之比分别是Ｃ犯的，ＩＭｅｔｌ６２ＣｓＭｅｔｌ６２ＳａｒＭｅｔｌ６２ＧｌＵｊＭｅｔｌ６２ＡｓｎＭｅｔｌ６２ＰｈｅＨｉｓｌ６６Ａｓｎ，ｙ，，，，ＳｅｒｌＯｌＡｌａ均利于甲酸的生成，突变体水解产物中甲酸和甲鼠胺之比分别是）Ｃ犯的２．９倍、２．８倍、７．８倍、３．２倍、１乂倍、１．３倍、１．７倍和２乂倍；组６２Ａ一合突变体（Ｍｅｔｌｌａ／Ｓｅｒｌ０１Ａｌ

8、车Ｍｅｔｌ６２Ｃｓ／Ｓｅｒｌ０１Ａｌａ