离子交换树脂层析分离混合氨基酸.doc

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1、实验二离子交换树脂层析分离混合氨基酸【实验目的】1.了解离子交换树脂层析的工作原理及操作技术。2.学会用离子交换树脂层析法分离混合氨基酸。【实验原理】离子交换树脂是一种合成的高聚物，不溶于水，能吸水膨胀。高聚物分子由能电离的性基团及非极性的树脂组成。极性基团上的离子能与溶液中的离子起交换作用，而非极性的树脂本身物性不变。通常离子交换树脂按所带的基团分为强酸(＝R＝S03H)、弱(＝COOH)、强碱(＝N+＝R：)和弱碱(＝NH2＝NHR＝NR2)。离子交换树脂分离小分子物质如氨基酸、腺苷、腺苷酸等是比较理想的。但对生物大于物质如蛋白质是不适当的，因

2、为它们不能扩散到树脂的链状结构中。故如分离生物大子、可选用以多糖聚合物如纤维素、葡聚糖为载体的离子交换剂。本实验用磺酸阳离子交换树脂分离酸性氨基酸(天冬氨酸)、中性氨基酸(丙氨酸)碱性氨基酸(赖氨酸)的混合液。在特定的pH条件下，它们解离程度不同，通过改变脱液的pH或离子强度可分别洗脱分离。【实验材料】1．实验器材层析柱（1.6X20cm）；恒流泵；梯度混合器；试管及试管架；紫外分光光度计、磺酸阳离子交换树脂(Dowex50)2．实验试剂(1)2mol／LHCl(2)2mol／LNaOH(3)0.1mOl／LHCl(4)0.1mol／LNaOH(5

3、)pH4.2的柠檬酸缓冲液：0.lmol／L柠檬酸54m1加0.1mol／L柠檬酸钠46ml(6)pH5的醋酸缓冲液：0.2mol／LNaAc70ml加0.2mol／LHAc30ml(7)0.2％中性茚三酮溶液：0.2g茚三酮加100ml丙酮(8)氨基酸混合液：丙氨酸、天冬氨酸、赖氨酸各10m1加0.1mol／LHCl3m【实验方法】1.树脂的处理100ml烧杯中置约10g树脂，加25ml12mo1／LHCl搅拌2h，倾弃酸液，用蒸馏水充洗涤树脂至中性。加25ml12mol／LNaOH至上述树脂中搅拌2h，倾弃碱液，用蒸馏水洗涤至中性。将树脂悬浮于

4、50mlpH4.2柠檬酸缓冲液中备用。2.装柱取直径0.8cm～1.2cm、长度10cm～12cm的层析柱，底部垫玻璃棉或海绵圆垫，自顶部注入经处理的上述树脂悬浮液，关闭层柱出口，待树脂沉降后，放出过量的溶液，在加入一些树脂，至树脂沉积至8cm～10cm高度即可。于柱子顶部继续加入pH4.2柠檬酸缓冲液洗涤，使流出液pH为4.2为止，关闭柱子出口，保持液面高出树脂表面1cm左右。3.加样、洗脱及洗脱液收集打开山口使缓冲液流出，待液面几乎平齐树脂表面时关闭出口(不可使树脂表面干燥)。用长滴管将15滴氨基酸混合液仔细直接加到树脂顶部，打开出口使其缓慢流

5、入柱内。当液面刚平树脂表面时，加入0.1mol／LHCl3ml，以10滴／min～12滴／min的流速洗脱，收集洗脱液，每管20滴，逐管收存。当HCl液面刚平树脂表面时，用1m1pH4.2柠檬酸缓冲液冲洗柱壁一次，接着用2mlpH4.2柠檬酸缓冲液洗脱，保持流速10滴／min～12滴／min并注意勿使树脂表面干燥。在收集洗脱液的过程中，逐管用茚三酮检验氨基酸的洗脱情况，方法是：于各管洗脱液中加10滴pH5醋酸缓冲液和10滴中性茚三酮溶液，沸水浴中煮10min，如溶液呈紫蓝色，表示已有氨基酸洗脱下来。显色的深度可代表洗脱的氨基酸浓度，可比色测。在用p

6、H4.2柠檬酸缓冲液把第二个氨基酸洗脱出来之后，再收集两管茚三酮反应阴性部分，关闭层析柱出口，将树脂顶部剩余的pH4.2柠檬酸缓冲液移去。于树脂顶部加入2ml0.1mo1／LNaOH，打开出口使其缓慢流入柱内，按上面I续用0.1mo1／LNaOH洗脱并逐管收集(注意仍然保持流速10滴／min～12滴／min)，每管20滴。做洗脱液中氨基酸检验，在第三个氨基酸用0.1mo1／LNaOH洗脱下来以后，再继续收集两管茚三酮反应阴性部分。最后以洗脱液管号为横坐标，洗脱液各管光密度（以水作空白，在570nm波长读取吸光度）或颜色深浅（以-，±，+，++．．．

7、表示）为纵坐标作图，即可画出一条洗脱曲线。【注意事项】1.在装柱时必须防止气泡、分层及柱子液面在树脂表面以下等现象发生。2.一直保持流速10滴/min～12滴／min，并注意勿使树脂表面干燥。【思考题】1.为什么混合氨基酸从磺酸阳离子交换树脂上逐个洗脱下来?2.树脂如何保存?Experiment13SeparatingMixedAminoAcidsbyIon–ExchangeChromatography【Purpose】1.Knowtheprincipleandoperatingtechniquesofion-exchange-resinchrom

8、atography.2.Learntouseion-exchange-resinchromatographytosepar