微生物工程方向专业实验.doc

《微生物工程方向专业实验.doc》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。

1、微生物工程方向专业实验指导书第一部分沙门氏菌的分离与鉴定前言沙门菌属是一大群寄生于人类和动物肠道，其生化反应和抗原构造相似的革兰氏阴性杆菌。种类繁多，少数只对人致病。其他对动物致病，偶尔可传染给人。主要引起人类伤寒，副伤寒以及食物中毒或败血症。在世界各地的食物中毒中，沙门氏菌食物中毒常占首位或第二位。食品屮沙门氏菌的检验方法有五个基本步骤：1前增菌；2选择性增菌；3选择性平板分离沙门氏菌；4生化试验，鉴定到属；5血清学分型鉴定1沙门氏菌的分离1.1材料1.2菌种沙门氏菌〈Salmonellasp.）大肠

2、埃希氏菌（E.col.）1.3检样鱼内脏，禽的内脏、肉等1.4培养基的配制：煌绿蛋白腺增菌液：称取本品93.55g,溶解于1050ml蒸僚水中，加热煮沸，临用前加入20%碘液20ml,0.5%煌绿2ml,现配现用，不宜久置。注释：蛋白腺和牛肉粉提供碳源、氮源和维生素满足细菌生长的需求:氯化钠町维持均衡的渗透压：碳酸钙能屮和細菌产酸及吸收有毒的代谢产物；硫代硫酸钠和四硫磺酸钠结合可抑制肠道共生菌（四硫磺酸钠是在培养基加入碘和碘化钾时形成），而具有四硫磺酸钠还原酶的细菌能在此培养基屮繁殖：胆盐可抑制大肠群菌

3、和其它革兰氏阳性杆菌。亚硫酸锡琼脂（BS）：取50.3g粉末加入1000ml蒸水中，加热煮沸致完全溶解冷却至55度,倒入无菌培养皿中，该培养基不需要高温高压.保存于黑暗处,48小吋内使用。注釋：蛋白陈、牛肉浸粉捉供碳源、氮源、维生素和矿物质；葡萄糖捉供能源；亚硫酸祕指示剂抑制革兰氏阳性菌和大肠菌群，但不影响沙门氏菌的生长；磷酸氢二钠是缓冲剂；硫酸亚铁用于产生硫化氢，并与铁产生沉淀，使阳性培养物为具有金屈光泽的棕邑到黑邑菌落；琼脂是培养基的凝固剂。三糖铁琼脂（TSI）：称取本品64.5克，加热溶解于100

4、0ml蒸帼水中，加热煮沸1分钟，分装16mmxl50mm试管，121°C高压灭菌15分钟。制成斜面长4-5cm,感匕长2・3cm。注释；蛋白腺、牛肉粉提供氮源、维生素、矿物质；乳糖、葡萄糖、蔗糖为可发酵糖类，其产酸时通过酚红指示剂测出，酸性呈黄色，碱性呈红色；硫代硫酸钠可被某些细菌还原为硫化氢,与硫酸亚铁中的铁盐生成黑色硫化铁；氯化钠维持均衡的渗透压；琼脂是培养基的凝固剂。沙门氏菌在37°C培养24-48小时后，棕褐色或灰色至黑色，有时有金属光泽，周围培养基呈棕色或黑色，有些菌株呈灰绿色，周围培养基不变

5、或微变暗。尿素培养基：赖氨酸脱竣酶试验培养基：用接种针从平板上挑取己纯化分离的同一菌落接种于所需要的试验的试管中（安培管），加入灭菌的液体石蜡覆盖培养基液面。注释：试验关培养基中含有赖氨酸和葡萄糖，酸碱指示剂为漠甲酚紫（中性和碱性时紫色,酸性黄色），未用时为紫色。如果待测细菌将赖氨酸脱竣，则产生胺，为碱性，浪甲酚紫保持紫色，如果不脱竣，肠杆菌科的细菌都能分解葡萄糖，产酸，漠甲酚紫变为黄色。靛基质培养基称取本品1.55g，加热溶解于100ml蒸馆水中，分装试管,121°C高压灭菌15分钟备用。注释：蛋白豚

6、提供碳氮源、维生素和生长因子；氯化钠维持均衡的渗透压；含有色氨酸酶的细菌，能分解蛋白陈中的色氨酸，形成靛基质（呵味）。靛基质无色，当加入对氨基苯甲酸试剂后，形成可见的红紫色醍式化合物，即玫瑰靛基质。1.5器具试剂瓶、三角瓶、枪头、平皿、金属匙或玻璃棒、接种棒、试管架。1.6步骤1.6.1采样与増菌广州部分地区市场在售肉鸡：用无菌棉签挑取鸡肠腔内容物1份，放入2nd的离心管中，将无菌棉球挑取的鸡肠腔内容物无菌操作放入装有5毫升煌绿蛋白月东增菌液的试管中，于37°C温箱中培养24小吋1.6.2分离培养取增菌

7、培养物划线接种到亚硫酸钮琼脂（BS）选择培养基上,37°C温箱培养24小时。观察各个平板上生长的菌落。先观察混合菌种平板，再检查样品平板上有无可疑菌落，挑取菌种平板和样品平板上的可疑菌落进行革兰氏染色与镜检。1.6.3三糖铁高层琼脂初步鉴别将上述革兰氏阴性杆菌的可疑菌落，挑取数个接种一支三糖铁高层琼脂斜而，于37°C培养18〜24h・初步判断是否可疑沙门氏菌。1.6.4生化试验在接种三糖铁琼脂的同吋，接种靛基质培养基、尿素琼脂（pH7.2）、W酸脱竣酶试验培养基及对照培养基各1管，于37°C培养18〜2

8、4h,必要时可延长至48h,判定结果。1.6.5血清学实验采用平板凝集法。用接种环圈蘸取沙门氏杆菌A—F群0多价血清至玻片上3~4环，再用接种棒挑取S.S培养基分离典型菌落少许混匀。并用生理盐水和大肠杆菌作对照比较.观察是否出现絮状凝集沉淀，从而初步筛选出沙门氏菌。2结果综合以上生化试验和血清学分型鉴定的结果，按照表或有关沙门氏菌属抗原表判定菌型，并报告结果。3思考题3.1如何提高沙门氏菌得检出率？3.2沙门氏在三糖铁培养基上的反应结果如何