预防兽医学技术-PCR基因克隆实验指导.doc

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1、预防兽医学实验技术一（基于PCR的基因克隆）PCR克隆常用技术一、用氯化钙制备新鲜的大肠杆菌感受态细胞二、质粒的转化三、PCR四、琼脂糖凝胶电泳五、阳性转化子的快速鉴定六、质粒DNA的小量制备七、如何进行限制酶切反应八附：基因工程基本知识简介(一)基因工程宿主菌(二)、基因工程载体与质粒(三)、基因克隆的连接(四)、关于DNA的去磷酸化(五)、质粒及其转化菌命名基因克隆－将PCR产物克隆于T载体中基因克隆的方式有多种，其中以PCR的方法先对目的基因进行扩增，然后将PCR产物连接到T载体中是应用最普遍的一种方法。常用的PCR　DNA多聚酶（如：Taq,TaqPlus等）在DNA双链分子末端有不

2、依赖于模板的延伸活性，其PCR产物的末端并不是平端，而是在3｀端伸出一个碱基，形成3｀凸端，3｀凸端的碱基主要A，因此，PCR产物的克隆大多使用T载体。但少数DNADNA多聚酶并无此活性，如Pfu酶，则PCR产物为平端，则需在PCR扩增最后延伸阶段加入Taq酶，使PCR产物的3｀端再加一个A。另一方式是在PCR引物的5｀端加上酶切位点，PCR产物酶切后直接克隆到载体相应的酶切位点之间。TA克隆的整个过程如下：1．基因扩增（PCR或RT－PCR）：过程包括目的基因的扩增及扩增产物的电泳鉴定二个步骤2．PCR产物的回收（过程包括DNA的琼脂糖凝胶电泳、目的DNA条带的回收及回收产物的电泳鉴定三个

3、步骤）。3．PCR产物与T载体连接：1h-过夜4．连接产物转化于DH5α受体菌，12-16h5．阳性转化子的筛选：PCR法6．质粒的提取、鉴定：试剂盒提取、酶切鉴定7．菌种、质粒的保存：如果只是克隆某一个基因，在一般情况下挑选三个阳性克隆即够了。鉴定好的克隆要妥当保存：必须保存一份质粒、同时保存菌种则更好。质粒与菌种的命名要规范、一致，同时在保存管上记录好时间。细菌在10-15%的甘油中，在-20℃可保存2-3年，在-70℃则可长期保存。这可用于菌种的保存。如果欲克隆的基因有多态性，一次又不能全部进行序列测定，则可先将快速鉴定的阳性转化子保存或快速提取质量保存，分批次测序鉴定。8．基因测序：

4、基因测序一般送质粒或携带质粒的细菌至测序公司进行。一般每个反应可测定出800bp，测序质量好的常可读出900bp甚至1000bp。注：从公司返回的结果时常见到张冠李戴者，如果同一个基因的克隆同时送几个去测序出现这种情况，就难于辨别开。因此，同一个基因的不同克隆送至同一公司时，送两个时送正反向克隆各一个为宜。三个以上的克隆则要同时测序，可将各个克隆的命名取得相差大些以下为PCR克隆常用技术一、用氯化钙制备新鲜的大肠杆菌感受态细胞下面的方案常用于成批制备感受态细菌，这些细菌可使每微克螺旋质粒ＤＮＡ产生5x106-2x107个转化菌落，这样足以满足所有在质粒中进行的常规克隆的需要。该方法完全适用于

5、大多数大肠杆菌菌株。　　 1.从于37℃培养16-20小时的新鲜平板中挑取一个单菌落（直径２－３mm），转到一个含有200mlLB或SOB培养基的500mL盐水瓶中。于37℃剧烈振摇培养约３小时。为得到有效转化，活细胞数不应超过108细胞ml，可每隔20-30分种测量OD600值来监测培养物的生长情况。在菌株与菌株之间，ＯＤ600值和每毫升中活细胞数间的关系变化很大，因此有必要通过测量特定大肠杆菌菌株的生长增减物在生长周期的不同时相的ＯＤ600值，并将各稀释度的培养物铺于无抗生素的ＬＢ琼脂平皿以计算每一时相的活细胞数，从而使分光光度读数得到标化。α（在常用的受体菌中：DH5α、JM109和B

6、L21（DE3）中，　眼观密度的高低以DH5α≤JM109≤BL21（DE3）为宜）2.将细菌转移到一个无菌250ml离心管中，在冰上放置10分钟，使培养物冷却至０℃。于４℃6000转/分离心10分钟，以回收细胞。切记：下述所有步骤均不能有DNA污染、所用耗材均不能有DNA污染。3.弃上清，将管倒置（于灭菌吸水纸上）以使最后残留的痕量培养液流尽。4.以1/10培养物体积的冰预冷的0.1mol/L（或75mM）CaCl2重悬每份沉淀，放置于冰浴上10min。5.于４℃以6000转/分离心10分钟，以回收细胞。6.弃上清，将管倒置（于灭菌吸水纸上）以使最后残留的痕量液体流尽。　7.重复5－8步骤

7、一次8.每100ml初始培养物用2ml用冰预冷的0.1mol/LCaCl2重悬每份细胞沉淀。将重悬物置冰水中，并于此时４℃放置12-24小时（注：5小时后可进行转化，以初步观察感受态的转化率），再加入30%的无菌甘油2ml，混均后将细胞分成小份，放于-70℃冻存。　　Dagert和Ehrlich(1979)曾表明细胞可以于４℃在CaCl2溶液中保存24-48小时，在贮存的最初12-24小时内，转化效率增加３－