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1、研究课题：连云港海域养殖条斑紫菜丝状体黄斑病病原体的分离及鉴定导师：王洪斌副教授生工052夏亚明答辩提纲：研究背景知识研究内容及意义实验材料实验方法与结果结论问题与展望研究背景知识紫菜养殖阶段丝状体培育叶状体养殖黄斑病泥红病于贝壳内进行形成壳孢子赤腐病壶状病08年夏天连云港海域紫菜养殖场在丝状体培育期大面积出现黄斑病，大量紫菜最后烂死，导致严重经济损失。条斑紫菜(Porphyrayezoensis)是我国主要紫菜栽培种，每年创造几十亿美元的产值，随着条斑紫菜栽培规模的不断扩大在其栽培过程中经常会遇到病害、发育调节等各种问题，其病害问题表现得越来越突出。多年来的大量研究表明，

2、紫菜的病烂由多方面原因引起的，致病原因也非常复杂，其中微生物因素是不可忽视的重要原因之一。研究内容及意义以往人们多从紫菜本身寻找解决途径，忽略了在此过程中微生物的重要作用。找出黄斑病的病原体并对其进行一定研究，从而对该病进行防治，减少经济的损失。病原菌的分离纯化形态、生长特性研究生理生化鉴定到属分子生物学鉴定到种实验材料1、样品紫菜贝壳样本取自于连云港海域紫菜养殖场（由李信书博士惠赠），海水取自于连云港连岛海域。2、培养基2216E培养基：蛋白胨5g，酵母膏1g，陈海水1000ml，5M氢氧化钠溶液调pH值7.6～7.8。固体培养基另加2%的琼脂粉。实验方法与结果1、病原菌分

3、离菌株富集菌液稀释平板涂布将一定量的陈置海水煮沸进行消毒，静止冷却后，对样本贝壳进行冲洗，洗刷干净。于无菌超净工作台内用菌铲将有黄斑病害的贝壳深层处刮取一定粉末，加入2216E培养基中过夜培养。十倍稀释法：取8个1.5mlEP管，分别标记1-8，吸取90ul无菌生理盐水于1.5ml的EP管（1-8号），向1号管加入10ul菌液，混匀，从1号管取10ul至2号管，混匀，依次至8号，以上操作均无菌条件下进行。取3个平皿分别标记为10-4，10-5，10-6，将原先配制好的固体2216E培养基，加热溶解，趁热，倒平板，冷却凝固后从4，5，6号EP管中分别取100ul菌液对应加入平皿

4、中，涂布，倒扣于28℃生化培养箱中培养12小时。2、人工回复感染将分离出来的菌株分别命名为HYWX-1、HYWX-2。取2号菌在2216E液体培养基过夜培养，血球计数板测定菌体浓度为7.665×108个/ml。挑选健康的紫菜贝壳样本放入俩个玻璃缸中培养（海水500ml），标记为2号，每天向其中加入12ml菌液（2×108个/ml）,同时以不加有菌体的空白样本为对照，观察感染现象。取HYWX-2号菌株经过回复感染实验，发现其能使健康紫菜贝壳样本感染，于第15天显示出黄色斑，对照组无病害出现。结果如图：3、菌株形态在光学显微镜下观察菌体形态，进行革兰氏染色，并用测微尺测量菌体大小

5、。HYWX-1革兰氏染色菌体大小为HYWX-1：1.7-2μm×0.8-1.2μm；HYWX-2：2.2-2.7μm×0.7-1.3μm。HYWX-2革兰氏染色HYWX-2HYWX-1俩株菌均革兰氏染色均为阴性，杆状菌，两株菌的平板菌落形态均为圆形、湿润、边缘光滑、中间突起，其中HYWX-1呈现透明状，HYWX-2呈乳白色。4、菌株生长曲线的绘制将菌株活化后分别以5%的接种量接种到2216E液体培养基，在各菌的最适生长条件下培养，从0h起，在1h取样,之后每隔2h取出于OD600下测定菌液浓度,至24h后每4h取样一次，持续40小时，以未接种菌株的培养基做空白。根据数据结果绘

6、制生长曲线。HYWX-1生长曲线图两株菌的延滞期均为1h左右，菌株HYWX-1约在16小时左右进入稳定期，稳定期时间较长，菌株HYWX-2约在培养16h后进入稳定期。HYWX-2生长曲线图5、菌株的生理生化特征按照微生物实验方法，进行各种生理生化反应。HYWX-1能水解明胶，氧化酶阳性，接触酶阳性，ONPG反应阳性，H2S试验阳性，葡萄糖氧化发酵(O/F）试验为氧化型，VP试验阴性，不能产生吲哚，能利用甘油、丙氨酸、谷氨酸、丙酮酸，不利用乳糖、果糖、纤维二糖、麦芽糖。HYWX-2能水解明胶，氧化酶为阳性，接触酶阳性，ONPG阳性，H2S试验阴性，能发酵葡萄糖，甲基红，VP阴性

7、，能产生吲哚；能利用乳糖、纤维二糖、甘油、丙氨酸、谷氨酸、丙酮酸，而不能利用麦芽糖。特征/菌株号氧化酶VP吲哚甲基红明胶试验硫化氢葡萄糖发酵HYWX-1＋－－＋＋＋＋HYWX-2＋－＋＋＋－＋特征/菌株号苯丙氨酸脱羧酶ONPGHYWX-1＋＋HYWX-2＋＋特征HYWX-1HYWX-2柠檬交替假单胞菌P.citrea游海假交替单胞菌P.haloplanktis麦氏假交替单胞菌P.macleodri红色假交替单胞菌P.rubra橙色假交替单胞菌P.aurantia需要有机生长因子--nd+-+-色素dd+