云南省甘蔗白叶病病原巢式PCR检测技术规程2018征求意见稿.doc

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1、云南省甘蔗白叶病病原巢式PCR检测技术规程2018征求意见稿　　ICS65.020B15中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局备案号DB53/TXXXXX—2018甘蔗白叶病病原巢式PCR检测技术规程2018-XX-XX发布2018-XX-XX实施云南省质量技术监督局发布DB53/TXXXXX—2018I前言本标准按照GB/T1.1－xx《标准化工作导则第1部分标准的结构和编写》给出的规则起草。　　本标准由云南省农业科学院提出。　　本标准由云南省农业标准化技术委员会(YNTC07)归口。　　本标准起草单位云南省农业科学院甘蔗研究所

2、。　　本标准主要起草人仓晓燕、黄应昆、李文凤、王晓燕、张荣跃、单红丽、罗志明、尹炯。　　DB53/TXXXXX—20181甘蔗白叶病病原巢式PCR检测技术规程1范围本标准规定了仪器与器材、试剂、采样及样品处理、DNA提取、巢式PCR检测、及结果判定等。　　本标准适用于甘蔗白叶病病原巢式PCR检测。　　2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。　　凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。　　凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。　　GB/T28067甘蔗黄叶病毒实时荧光RT-PC

3、R检测方法。　　3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。　　3.1巢式PCR巢式PCR是一种使用两对PCR引物扩增完整的片段，第一对PCR引物扩增片段和普通PCR相似，第二对引物结合在第一次PCR产物内部，使得二次PCR扩增灵敏度高于一次PCR扩增的变异聚合酶链反应。　　4缩略语下列缩略语适用于本文件。　　bp碱基对(basepair)CTAB十六烷基三甲基溴化铵(HexadecylTrimethylAmmoniumBromide)dNTPs脱氧核苷三磷酸混合液(DeoxyribonucleosideTriphosphatesmi

4、xture)ddH2O双蒸水EDTA乙二胺四乙酸(EdetateDisodium)PCR聚合酶链式反应(Polymerasechainreaction)Tris三羟甲基氨基甲烷(HydroxymethylMethylAminomethane)5仪器与器材、试剂5.1仪器与器材DB53/TXXXXX—20182仪器与器材包括台式离心机、小型离心机、微量可调移液器、恒温水浴锅、旋涡混匀仪、核酸蛋白分析仪、PCR扩增仪、电泳槽、电泳仪等电泳装置、凝胶成像仪、冰箱（温控范围4℃和-20℃）、高压灭菌锅、鼓风干燥箱、液氮罐、电子天平、带滤芯

5、移液头、PCR反应管等。　　5.2试剂除另有规定外，所用试剂均为分析纯。　　5.2.1DNA提取试剂DNA提取试剂及配制方法见附录A。　　5.2.2PCR试剂PCR试剂及配制方法参见附录A。　　5.2.3电泳缓冲液储存液为50倍TAE电泳缓冲液，配制方法见附录A，工作液用ddH2O将储存液稀释50倍后获得。　　5.2.4扩增产物检测试剂琼脂糖、Goldenview核酸染料、6倍上样缓冲液、DNA分子量标准。　　6采样及样品处理6.1采样工具采样工具处理按照GB/T28067的要求执行。　　6.2采样方法采样方法参照GB/T2806

6、7的要求执行。　　其中，叶片样品采集时首选疑似甘蔗白叶病病株，具体参见附录B，样品独立分装，编号备用。　　6.3样品保存样品存放与运送按照GB/T28067要求执行。　　7DNA提取DNA提取方法参见附录A8巢式PCR检测巢式PCR检测方法参见附录C。　　9结果判定DB53/TXXXXX—20183阳性对照有条带，阴性对照和空白对照无条带时，检测结果有效，当检测结果有效时，依据表1进行结果判定。　　表1判定表目的条带大小（bp）样品阳性对照阴性对照空白对照结果判定1240有有无无含白叶病植原体1240无有无无不含白叶病植原体DB5

7、3/TXXXXX—20184AA附录A（规范性性附录）DNA提取A.1DNA提取试剂配制DNA提取试剂配制方法见表A.1。　　表A.12倍CTAB抽提缓冲液组分配制量（L）配制方法1.0mol·L-1Tris-HCl(pH8.0)母液1称取121.0gTris，溶解于800mL的ddH2O中，用6mol·L-1的HCL调节pH至8.0后，用ddH2O定容到1.0L。　　0.5mol·L-1EDTA(pH8.0)的母液1称取186.0gNa2EDTA·2H2O，加入800mLddH2O，充分搅拌，用2mol·L-1的NaOH调节pH

8、至8.0后，用ddH2O定容到1.0L。　　2倍CTAB抽提缓冲液1依次加入20g的CTAB粉末，100mL的1.0mol·L-1的Tris-HCl(pH8.0)母液，40mL的0.5mol·L-1的EDTA(pH8.0)的母液，81.8g的NaC