文献讲读-何孟.ppt

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1、Aprototypetissueengineeredbloodvesselusingamnioticmembraneasscaffold何孟2012年12月6号1研究简介2实验材料和方法实验结果讨论与结论34目录基于薄片的TEBV天然支架TEBV1986年开始使用利用活体血管细胞和天然基质分子已有多例报道存在力学性能问题包含活的纤维母细胞和组织良好的基质天然蛋白收获和种植细胞花费时间，限制应用1.1方法比较一.研究简介1.2选材及原因去表皮化的AM无免疫源性，且它在眼部手术，表面移植的通畅性，已经在临床上得到验证对于促进上皮细胞粘连有重要作用以

2、AM为基质的培养的EC相应的表达更多的血管内钙连蛋白和整合素种植在AM上的内皮细胞（EC）的选择素E和选择素P的表达降低（相对于在培养皿培养），相应的其对于白血球的黏附也相应减少AM（羊膜）证明戊二醛交联的AM.可以缩短TEBV的合成时间并能解决内皮细胞对于TEBV的黏附问题将AM做成管状用戊二醛交联用猪血管内皮对材料进行内皮化在一定时间和生物条件下通过不同剪切力处理对细胞黏附进行表征戊二醛交联内皮化剪切力影响1.3实验思路二.方法和材料2.胰蛋白酶消化，刮去EC1.PBS无菌洗涤4.绕在聚四氟乙烯棒上3.无菌水冲洗，切块6.甘氨酸中和5.戊二

3、醛交联8.4℃无菌保存7.双蒸水冲洗交联AM管AM棒去上皮的AM人的AMAM的获取2.1AM的准备和支架制备2.2细胞培养猪动脉上皮细胞的提取（步骤同前）甘氨酸处理后，低速离心获得细胞M199重悬后传代培养（1:3传代）取P2，P3代细胞进行实验41232.3TEBV的剪切力测试1交联的AM管内壁种植EC密度：2×105cm-22培养两天，TEBV上形成单层细胞，然后放入进行生物反应器测试（测试时间均为四天）TEBV流速控制培养液存储器微型搏动泵生物反应器构成剪切力计算公式τ：剪切力（达因每平方厘米）1达因=10-5牛η：培养液粘稠度d:TEB

4、V的内壁直径Q:流速（立方厘米每秒）通过流速控制剪切力大小测试及检验方法实验组通过控制流速使剪切力在0.5-12达因的范围培养2-4天，进行免疫学和组织学检测对照组在静止状态下，采用相同条件进行培养培养时间相同，进行相同检测检验AM管内细胞通过核染色进行计数随机抽取三个区域进行荧光显微计数并拍照2.4免疫荧光染色肌动蛋白用AlexaFluor-phalloidin染色PECAM-1(血小板内皮细胞黏附因子-1)，用小鼠抗大鼠CD31抗体结合，再用与与荧光蛋白结合的山羊抗小鼠IgG蛋白染色VE-钙粘蛋白：用大鼠抗猪的CD144抗体结合，再用德州红

5、共轭的山羊抗小鼠IgG蛋白染色整合素β1：小鼠抗猪整合素β1的抗体结合，再用荧光蛋白结合的山羊抗小鼠蛋白染色细胞核：碘化丙啶染色共聚焦显微镜和荧光显微镜观察2.5蛋白印迹分析EC细胞蛋白的SDS-PAGE电泳转移到PVDF膜脱脂牛奶封闭小鼠抗大鼠PECAM-1抗体标记PECAM-1小鼠抗猪VE-钙粘蛋白标记VE-钙粘蛋白HRP（辣根过氧化物酶）结合的IgG二抗标记显色分析2.6统计学分析t分布检验选取显著值P<0.05标准误的方法表示结果（SEM）三.实验结果3.1剪切力的影响内皮化剪切力处理观察结果取制备好的AM管用猪的内皮细胞进行内皮化培养

6、两天实验组用在有剪切力的情况下培养四天对照组培养相同时间进行核染色计数随机抽样计数经显微观察细胞数目无明显变化3.2免疫荧光研究肌动蛋白和细胞核染色肌动蛋白：绿色细胞核：红色显示出了细胞的方向性3.2免疫荧光研究PECAM-1和VE-钙粘蛋白的分布和表达分析PECAM-1：蓝色VE-钙粘蛋白：绿色PECAM-1和VE-钙粘蛋白的分布性差异3.2免疫荧光研究整合素β1的分布和表达分析整合素β1：蓝色细胞核：红色A-F显示：静止培养时只在AM与EC作用面表达，剪切力影响下，出现其在细胞间的表达量3.3蛋白印迹研究分别增长72±9%67±7%3.3蛋

7、白印迹研究增长25±9%激活的整合素却有降低整合素αvβ3的分布和表达分析整合素αvβ3：蓝色细胞核：红色A-F显示：剪切力对其分布无影响整合素αvβ3的表达分析分别增加29±8%和53±13%其中P<0.05AM作为TEBV合成材料的优势AM最大承受腔内压力300mmHg材料合成周期短AM与细胞的黏附性良好，促进黏附因子表达基质凝胶蛋白存在力学性能缺陷基于薄片的组织工程相对耗时四.结果与讨论PGA黏附的EC会被血流冲刷脱落人工聚合物和天然基质在移植时经常出现内皮细胞脱落问题生物相容性已得到临床验证关于测得β-肌动蛋白含量减少的解释但是其他黏附

8、因子的相对含量仍有升高β-肌动蛋白含量显示较少剪切力处理提高了PECAM-1和VE-钙粘蛋白的表达量剪切力处理剪切力处理后，EC比较难从AM上用解离下