L10-RNAi-07.ppt

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1、RNAiRNAi的发现1995年，康乃尔大学，SuGuo博士秀丽新小杆线虫（C.elegans）的par-1基因反义RNA阻断基因的表达；正义RNA增强基因的表达但是：二者都同样地切断了par-1基因的表达途径1998年，华盛顿卡耐基研究院的AndrewFire马萨诸塞大学医学院的CraigMello体外转录所得RNA中污染了微量双链RNA而引起单链RNA基因抑制效应十分微弱；双链RNA能够高效特异性阻断相应基因的表达。该小组将这一现象称为RNA干扰（RNAinterference,简称RNAi）RNAi现象被广泛地发现于真菌、拟南芥、水螅、涡虫、

2、锥虫、斑马鱼等大多数真核生物中RNAi（RNAinterference，RNA干扰)*一些短片断的双链RNA可以通过促使特定基因的mRNA降解来高效、特异的阻断体内特定基因表达，诱使细胞表现出特定基因缺失的表型。*这种现象发生在转录后水平，又称为转录后基因沉默(post-transcriptionalgenesilencing，PTGS)。*近年来，RNA干扰的研究成为热点，预测未来10年间最有可能出重大成果的领域之一，并被《Science》评选为2002年度最重要科技突破的首位。RNAi是细胞本身固有的对抗外源基因及其侵害的一种自我保护现象，是双

3、链RNA(doublestrandedRNA，dsRNA)分子在mRNA水平关闭相应序列及基因的表达使其沉默的过程。dsRNA:double-strandedRNA，双链RNADicer:核酸内切酶，RNA酶III家族中的一种siRNA:smallinterferingRNA，小干涉RNA。具有一些共性：一般为长21～23个碱基对的双链；3'端具有2个突出的碱基，多为尿嘧啶，也可以是胸腺嘧啶且具有羟基；5'端被磷酸化。RISC:RNA-inducedsilencingcomplex，RNA诱导的沉默复合体RdRP：RNAdependentRNAPo

4、lymeraseRNAi的作用机制dsRNA导入细胞RdRP￬Dicer切割21-23ntsiRNA￬与RISC结合激活RISC的内切酶活性￬特异性的切割与siRNA配对的mRNA￬mRNA降解RNAi的特点高效性Elbashir等在研究中发现分别为25nmol/L与100nmol/L的dsRNA产生的结果是一样的，只有当浓度降低到0.05nmol/L时，沉默的效果才消失。Holen等也证实1～100nmol/L的双链RNA浓度对基因沉默的效果是一致的。特异性Elbashir等和Brummelkamp等发现在21～23个碱基对中有1～2个碱基错配会

5、大大降低对靶mRNA的降解效果。RNAi的特点需要ATPZamore等认为RNAi过程中至少有2个步骤需要能量的供给：一是dsRNA被Dicer所酶切产生siRNA；二是在siRNA与RISC结合解链后形成有活性的RISC。位置效应Holen等根据人TF(tissuefactor)不同的位置各合成了4组siRNA，hTF167i和hTF372i能够抑制85％～90％的基因活性，hTF562i只能抑制部分基因活性，而hTF478i则几乎没有抑制基因的活性。结果还表明siRNA对mRNA的结合部位有碱基偏好性，GC含量较低的mRNA被沉默效果较好。RN

6、Ai的特点竞争效应Holen等将10nmol/L和30nmol/L的hTF167i相比，两者的沉默基因效果无差异，但将20nmol/L基因抑制效果很差的PSK314i和10nmol/L的hTF167i相混和后，hTF167i产生的抑制效果明显降低。可传播性在线虫中，双链RNA可以从起始位置传播到远的地方，甚至于全身。Feinberg和Hunter在线虫细胞膜上发现一种跨膜蛋白SID1，它可以将双链RNA转运出细胞，因此系统性的RNAi包括了SID1介导的双链RNA在细胞间的运输。RNAi技术的应用在功能基因组研究中，需要对特定基因进行功能丧失或降低

7、突变，以确定其功能。RNAi具有高度的序列专一性，可以特异地使特定基因沉默，获得功能丧失或降低突变，因此RNAi可以用于功能基因组的研究。一、RNAi技术在功能基因组研究中的应用1、编码区RNAi技术最初通过注射或浸泡等方法将dsRNA直接导入到线虫的性腺或早期胚胎中缺点：表型变化不能遗传细胞分裂造成dsRNA的稀释Tavernarakis等对RNAi技术进行了改进，将目的基因的靶序列以反向重复的方式，由热激启动子控制在转基因生物中表达。热激处理后，反向重复序列在细胞内开始转录，其产物会形成dsRNA，从而使目的基因沉默。优点：1、转基因可以遗传给

8、后代，有利于突变的分析；2、dsRNA可以被诱导产生，RNAi能够在发育特定阶段出现，从而使研究发育早期必需基因在发育晚期