免疫组化ABC法.ppt

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1、免疫组化ABC法组织抗原第一抗体第二抗体HRP生物素亲和素原理：酶标记Biotin形成酶素化Biotin一ABC法酶素化Biotin＋Avidin---ABC复合物抗原---特异抗体---Biotin标记二抗---Avidin●Biotin●HRP实验原理步骤：三步法优点：敏感性较高特异性强应用范围广缺点：某些脏器存在内源性生物素干扰Avidin与糖基、纤维组织、核酸及细胞膜中磷脂有非特异反应实验步骤一、切片和脱蜡切5-10微米的薄片，贴于载玻片上，脱蜡后进行后续反应。步骤如下：（1）二甲苯脱蜡（2）梯度酒精水化（无水酒精、95%酒

2、精、90%酒精、85%酒精、80%酒精）二、微波修复抗原免疫组化ABC法实验步骤三、ABC法⑴含1%TritonX-100和0.03%H2O2的0.01mol/L磷酸盐缓冲液(PBS,pH7.4)室温15min；⑵含3%牛血清白蛋白(BSA,Sigma)和1%正常羊血清(NGS,Vector)的0.01mol/LPBS室温30min；免疫组化ABC法实验步骤⑶一抗室温孵育过夜。抗体用含3%牛血清白蛋白(BSA，Sigma)和1%NGS的0.01mol/LPBS稀释(下同)；⑷0.01mol/LPBS漂洗3次，每次5min;⑸生物素化

3、二抗室温孵育2h;免疫组化ABC法实验步骤⑹0.01mol/LPBS漂洗3次，每次5min;⑺ABC(1:100,Vector)室温2h;⑻0.01mol/LPBS漂洗3次，每次5min;⑼含0.03%DAB和0.006%H2O2的Tris盐酸缓冲液(TB,pH7.6)室温10~15min。免疫组化ABC法实验步骤（10）0.01mol/LPBS漂洗3次，每次5min;（11）贴片，甘油封片四、观察结果并分析免疫组化ABC法实验对照设置免疫组化ABC法对照染色的目的---排除假阴性和假阳性。