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时间:2020-01-20
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1、肺炎克雷伯菌分离鉴定标本:尿培养基:血平板、MAC(EMB、SS、XLD)KIA、MIU、葡萄糖蛋白胨水、枸橼酸盐培养基、鸟氨酸脱羧酶培养基及对照管试剂:革兰染液、荚膜染液、V-P试剂、吲哚试剂、95%乙醇溶液器材:孵育箱、接种环、酒精灯、显微镜基本特性直接涂片,镜下观察。接种:在镜下观察细菌的大致形态及其数量,直接将标本用接种环蘸取后接种在血平板、MAC(EMB、SS、XLD)上,进行培养。温育:37℃孵育18-24小时。观察菌落形态:血平板上形成圆形、凸起、灰白色、不溶血、光亮的大菌落,相邻菌落易于融合,粘液状,若用接种针蘸取呈长丝状拽起;MAC上形成乳糖发酵产酸的菌落,即红色或粉红色
2、、较大、浑浊、凸起、有光泽的粘液型菌落(EMB上是大、粘稠、红色、易溶于一片的菌落,SS上是红色或粉红色、或具有粉红中心的无色菌落,XLD上呈不透明黄色的菌落)。制片1.载玻片准备:玻片先在95%乙醇中去除油污,再在火焰上烧去粘附的乙醇,待冷,做好标记。2.涂片:在洁净无油腻的玻片中央放一小滴蒸馏水(或用接种环挑1-2滴水),用无菌的接种环挑取少量菌种与水滴充分混匀,涂成极薄的菌膜,涂布面积约1cm2。3.干燥:涂片在室温下使其自然干燥,也可以小心地在酒精灯上高处微微加热,使水分蒸发,但切勿紧靠火焰或加热时间过长,以防标本烤枯而变形。4.固定:手执玻片一端,有菌膜的一面朝上,通过微火三次(
3、手指触摸反面不烫手为宜),待玻片冷却后再进行染色。革兰染色:挑取可疑菌落涂在干净的玻片上自然晾干,用结晶紫(1液)覆盖细菌初染1min,清水冲洗干净玻片再滴加革兰染液(2液)媒染1min,清水冲去表面的染液,用95﹪乙醇(3液)脱洗约30s(以乙醇不再有颜色为好),最后用稀释的复红(4液)复染30s。自然晾干后在显微镜下观察形态。荚膜染色1.染色:玻片置于玻片搁架上,加适量(以盖满菌膜为度)草酸铵结晶紫(或石炭酸复红染液)于菌膜部位,染色1-2min。2.水洗:斜置载玻片,在自来水龙头(或洗瓶)下用小股水流冲洗,直至洗下的水呈无色为止。3.干燥:自然干燥或用吸水纸吸去涂片上的水,用吸水纸时
4、切勿将菌体擦掉。4.镜检:用高倍镜和油镜观察并绘细菌形态并绘图于记录表中。镜下形态:G-杆菌,卵圆形或球杆状细菌,长成双排列,有荚膜,无鞭毛。(如有需要,可进行荚膜染色,染色后菌体呈卵圆形或球杆状,成双排列,菌体外绕以明显的荚膜长较菌体宽2-3倍。)生化鉴别定科:氧化酶试验(-)、IMViC(--++)定属:KIA(AA+-)、MIU(--+)、O/F(F)、鸟氨酸脱羧酶试验(-)定种:吲哚(-)编码鉴定血清学鉴定氧化酶试验:氧化酶(细胞色素氧化酶)是细胞色素呼吸酶系统的最终呼吸酶。具有氧化酶的细菌,首先使细胞色素C氧化,再由氧化型细胞色素C将盐酸二甲基对苯二胺或盐酸四甲基对苯二胺氧化成红
5、色或蓝色的醌类化合物。主要用于肠杆菌科细菌与假单胞菌的鉴别,前者为阴性,后者为阳性。奈瑟菌属、莫拉菌属细菌也呈阳性反应。backI(吲哚):有些细菌具有色氨酸酶,能分解蛋白胨中的色氨酸产生吲哚,与对甲基氨基苯甲醛结合,生成红色化合物玫瑰吲哚。主要用于肠杆菌科细菌的鉴定。M(甲基红):某些细菌分解葡萄糖产生丙酮酸,丙酮酸可进一步分解为甲酸、乙酸等酸性物质,不再继续分解,故培养基pH在4.5以下,加入甲基红指示剂后呈紫红色(阳性)。有些细菌将分解葡萄糖产生的酸进一步转化为醇酮等非酸性物质,使培养基pH在6.2以上,加入甲基红试剂成橘黄色(阴性)。一般用于肠杆菌科各菌属的鉴别。Vi:某些细菌分解
6、葡萄糖生成丙酮酸,丙酮酸可进一步脱羧生成乙酰甲基甲醇,乙酰甲基甲醇在碱性环境下被氧化成二乙酰,后者与蛋白胨中的精氨酸所含的胍基起作用,生成红色胍缩二乙酰,为VP试验阳性。若培养基中胍基含量少,加入少量含胍基的化合物如肌酸肌酐,可加速其反应。一般用于肠杆菌科各菌属的鉴别。C(枸橼酸盐)枸橼酸盐培养基中不含任何糖类,枸橼酸盐为唯一碳源,磷酸二氢铵为唯一氮源。如果细菌能利用铵盐作为唯一氮源,并能利用枸橼酸盐作为唯一碳源,在枸橼酸盐培养基上生长,并分解枸橼酸盐为碳酸盐,使培养基变碱,指示剂溴麝香草酚蓝由绿色变为深蓝色,为枸橼酸盐利用实验阳性。若细菌不能利用枸橼酸盐为碳源,则细菌不能生长,培养基不变
7、色。backKIA(克氏双糖铁)克氏双糖铁斜面培养基,用酚红作指示剂,在酸性时呈黄色,碱性时呈红色,培养基中的葡萄糖含量仅为乳糖或蔗糖的1/10,若细菌只分解葡萄糖而不分解乳糖,分解葡萄糖产酸使ph降低,因此斜面和底层均先呈黄色,但因葡萄糖含量较少,所以生成的少量酸可因接触空气而氧化,并因细菌生长繁殖利用含氮物质而生成碱性化合物中和,使斜面部分又变成红色;底层由于处于缺氧状态,细菌分解葡萄糖所生成的酸类一时不被氧化而仍保
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