微生物 肺炎克雷伯.ppt

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1、肺炎克雷伯菌分离鉴定标本：尿培养基：血平板、MAC（EMB、SS、XLD）KIA、MIU、葡萄糖蛋白胨水、枸橼酸盐培养基、鸟氨酸脱羧酶培养基及对照管试剂：革兰染液、荚膜染液、V-P试剂、吲哚试剂、95%乙醇溶液器材：孵育箱、接种环、酒精灯、显微镜基本特性直接涂片，镜下观察。接种：在镜下观察细菌的大致形态及其数量，直接将标本用接种环蘸取后接种在血平板、MAC（EMB、SS、XLD）上，进行培养。温育：37℃孵育18-24小时。观察菌落形态：血平板上形成圆形、凸起、灰白色、不溶血、光亮的大菌落，相邻菌落易于融合，粘液状，若用接种针蘸取呈长丝状拽起；MAC上形成乳糖发酵产酸的菌落，即红色或粉红色

2、、较大、浑浊、凸起、有光泽的粘液型菌落（EMB上是大、粘稠、红色、易溶于一片的菌落，SS上是红色或粉红色、或具有粉红中心的无色菌落，XLD上呈不透明黄色的菌落）。制片1.载玻片准备：玻片先在95％乙醇中去除油污，再在火焰上烧去粘附的乙醇，待冷，做好标记。2.涂片：在洁净无油腻的玻片中央放一小滴蒸馏水（或用接种环挑1-2滴水），用无菌的接种环挑取少量菌种与水滴充分混匀，涂成极薄的菌膜，涂布面积约1cm2。3.干燥：涂片在室温下使其自然干燥，也可以小心地在酒精灯上高处微微加热，使水分蒸发，但切勿紧靠火焰或加热时间过长，以防标本烤枯而变形。4.固定：手执玻片一端，有菌膜的一面朝上，通过微火三次（

3、手指触摸反面不烫手为宜），待玻片冷却后再进行染色。革兰染色：挑取可疑菌落涂在干净的玻片上自然晾干，用结晶紫（1液）覆盖细菌初染1min，清水冲洗干净玻片再滴加革兰染液（2液）媒染1min，清水冲去表面的染液，用95﹪乙醇（3液）脱洗约30s（以乙醇不再有颜色为好），最后用稀释的复红（4液）复染30s。自然晾干后在显微镜下观察形态。荚膜染色1.染色：玻片置于玻片搁架上，加适量（以盖满菌膜为度）草酸铵结晶紫（或石炭酸复红染液）于菌膜部位，染色1-2min。2.水洗：斜置载玻片，在自来水龙头（或洗瓶）下用小股水流冲洗，直至洗下的水呈无色为止。3.干燥：自然干燥或用吸水纸吸去涂片上的水，用吸水纸时

4、切勿将菌体擦掉。4.镜检：用高倍镜和油镜观察并绘细菌形态并绘图于记录表中。镜下形态：G-杆菌，卵圆形或球杆状细菌，长成双排列，有荚膜，无鞭毛。（如有需要，可进行荚膜染色，染色后菌体呈卵圆形或球杆状，成双排列，菌体外绕以明显的荚膜长较菌体宽2-3倍。）生化鉴别定科：氧化酶试验（-）、IMViC（--++）定属：KIA（AA+-）、MIU（--+）、O/F（F）、鸟氨酸脱羧酶试验（-）定种：吲哚（-）编码鉴定血清学鉴定氧化酶试验：氧化酶（细胞色素氧化酶）是细胞色素呼吸酶系统的最终呼吸酶。具有氧化酶的细菌，首先使细胞色素C氧化，再由氧化型细胞色素C将盐酸二甲基对苯二胺或盐酸四甲基对苯二胺氧化成红

5、色或蓝色的醌类化合物。主要用于肠杆菌科细菌与假单胞菌的鉴别，前者为阴性，后者为阳性。奈瑟菌属、莫拉菌属细菌也呈阳性反应。backI（吲哚）：有些细菌具有色氨酸酶，能分解蛋白胨中的色氨酸产生吲哚，与对甲基氨基苯甲醛结合，生成红色化合物玫瑰吲哚。主要用于肠杆菌科细菌的鉴定。M（甲基红）：某些细菌分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸可进一步分解为甲酸、乙酸等酸性物质，不再继续分解，故培养基pH在4.5以下，加入甲基红指示剂后呈紫红色（阳性）。有些细菌将分解葡萄糖产生的酸进一步转化为醇酮等非酸性物质，使培养基pH在6.2以上，加入甲基红试剂成橘黄色（阴性）。一般用于肠杆菌科各菌属的鉴别。Vi：某些细菌分解

6、葡萄糖生成丙酮酸，丙酮酸可进一步脱羧生成乙酰甲基甲醇，乙酰甲基甲醇在碱性环境下被氧化成二乙酰，后者与蛋白胨中的精氨酸所含的胍基起作用，生成红色胍缩二乙酰，为VP试验阳性。若培养基中胍基含量少，加入少量含胍基的化合物如肌酸肌酐，可加速其反应。一般用于肠杆菌科各菌属的鉴别。C（枸橼酸盐）枸橼酸盐培养基中不含任何糖类，枸橼酸盐为唯一碳源，磷酸二氢铵为唯一氮源。如果细菌能利用铵盐作为唯一氮源，并能利用枸橼酸盐作为唯一碳源，在枸橼酸盐培养基上生长，并分解枸橼酸盐为碳酸盐，使培养基变碱，指示剂溴麝香草酚蓝由绿色变为深蓝色，为枸橼酸盐利用实验阳性。若细菌不能利用枸橼酸盐为碳源，则细菌不能生长，培养基不变

7、色。backKIA（克氏双糖铁）克氏双糖铁斜面培养基，用酚红作指示剂，在酸性时呈黄色，碱性时呈红色，培养基中的葡萄糖含量仅为乳糖或蔗糖的1/10，若细菌只分解葡萄糖而不分解乳糖，分解葡萄糖产酸使ph降低，因此斜面和底层均先呈黄色，但因葡萄糖含量较少，所以生成的少量酸可因接触空气而氧化，并因细菌生长繁殖利用含氮物质而生成碱性化合物中和，使斜面部分又变成红色；底层由于处于缺氧状态，细菌分解葡萄糖所生成的酸类一时不被氧化而仍保