兰大分子课件.ppt

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1、Chapter11.核酸的理化性质核酸的水解核酸的酸碱性质核酸的紫外吸收核酸的变性、复性与核酸杂交11.1核酸的水解核酸的水解分为酸水解、碱水解和酶水解三种类型。11.1.1酸水解糖苷键比磷酸酯键容易水解，嘌呤碱的N-糖苷键比嘧啶碱的N-糖苷键易水解。其中，嘌呤与脱氧核糖之间的糖苷键最易水解。因此，DNA在pH1.6于37ºC对水透析即可完全除去嘌呤碱。嘧啶糖苷键的水解常需要较剧烈的条件。11.1.2碱水解RNA的磷酸酯键易被水解，DNA的磷酸酯键相对较稳定。用于水解RNA的碱以KOH较好，水解后可用HClO4中和，由

2、于KClO4溶解度小，K+容易除去。碱浓度一般为0.3~1mol/L，室温至37ºC水解18~24h即可水解完全。11.1.3酶水解非特异性水解磷酸二酯键的酶为磷酸二酯酶(phospho-diesterase)，如蛇毒磷酸二酯酶和牛脾磷酸二酯酶。专一性水解核酸的磷酸二酯酶称为核酸酶(nuclease)。11.1.3.1核酸酶的分类按底物专一性分类，有核糖核酸酶(ribonuclease,RNase)，和脱氧核糖核酸酶(deoxyribonuclease,DNase).按照对底物的作用方式分为核酸内切酶(endonucl

3、ease，酶切作用点在多核苷酸链的内部)和核酸外切酶(exonuclease，酶切位点在多核苷酸链的末端，从末端逐个地将核苷酸切下)。小球菌核酸酶即可内切，也可外切。按照磷酸二酯键的断裂方式分为两类；一类在3'-OH端与磷酸基之间断裂，，其产物是5'-磷酸寡核苷酸，另一种是在5'-OH与磷酸基之间断裂，产物为3'-磷酸核苷酸或寡核苷酸。(4)作用于双链底物的叫双链酶，作用于单链的叫单链酶；核酸外切酶的作用方向等。11.1.3.2RNase类1.牛胰核糖核酸酶,简称RNaseI，只作用于RNA，最适pH值为7.0~8.2

4、，十分耐热。具有高度专一性，作用位点为嘧啶核苷酸-3'-磷酸与其它核苷酸之间的连接，产物为3'-嘧啶核苷酸；或以3'-嘧啶核苷酸结尾的寡核苷酸。其水解机理同RNA的碱水解。2.核糖核酸酶T1(ribonucleaseT1)，一种内切酶，耐热，耐酸，专一性高于RNaseI，，作用位点是3'-鸟苷酸与其相邻核苷酸的5'-OH之间的连键，产物是以3'-鸟苷酸为末端的寡核苷酸或3'-鸟苷酸。3.核糖核酸酶T2(RNaseT2),主要作用位点为Ap残基，可以将tRNA完全降解成3'-核苷酸结尾的寡核苷酸。11.1.3.3DNas

5、e牛胰核糖核酸酶(pancreaticdeoxyribonuclease,DNaseI)，切断双链或单链DNA成为以5'-磷酸为末端的寡核苷酸，平均长度为4个核苷酸，需镁离子激活，最适pH7~8。牛脾脱氧核糖核酸酶(spleendeoxyribonuclease,DNaseII)，此酶降解DNA成为3'-磷酸末端的寡聚核苷酸，平均长度为6个核苷酸，最适pH值4~5,需要0.3mol/L的钠离子激活，镁离子可以抑制此酶。链球菌脱氧核糖核酸酶(streptococcaldeoxyribonuclease)，作用于DNA，最

6、适pH7,需镁离子，产物为5'-磷酸为末端的碎片。限制性内切酶，在细菌中发现，主要是降解外源的DNA，具有严格的碱基序列专一性。如EcoRI，可以识别DNA链上6对碱基组成的序列，交错切割，形成的产物具有粘性末端。11.1.4N-糖苷酶11.2核酸的酸碱性质核酸的酸碱性质与其碱基、核苷、核苷酸的解离相关联。11.2.1碱基的解离碱基的解离与嘧啶和嘌呤化合物上的N原子有关系。1979111.2.2核苷的解离在核苷中，由于戊糖的存在，碱基的解离均受到一定的影响，一般会增加碱基的酸性解离。11.2.3核苷酸的解离由于磷酸基的

7、存在，核苷酸具有较强的酸性。在核苷酸中，碱基部分的解离与核苷相似，额外的两个解离常数是由磷酸基引起。这两个解离常数分别为pK'1=0.7~1.6和pK'2=5.9~6.5。由于核苷酸含有磷酸和碱基，是两性电解质，在不同的pH溶液中解离程度不同，在一定的pH条件下可形成兼性离子，对外不现电荷，此时的pH值就是核苷酸的等电点。由于鸟苷酸的碱基碱性很弱，测不出其含N环的解离曲线，所以不能形成兼性离子。从核苷酸的解离曲线可以得到,第一磷酸基和含氮环解离曲线的交叉处，核苷酸所带的电荷恰好为零，因此核苷酸的等电点为：核酸的滴定:核

8、酸的滴定曲线说明天然DNA与变性DNA的滴定曲线是不同的。I.从pH6.9用酸或碱正向滴定;II.从pH12或pH2.5分别用酸或碱反向滴定.11.3核酸的紫外吸收碱基、核苷、核苷酸和核酸在240~290nm有强烈的紫外吸收，最大吸收值在260nm。对待测核酸样品的纯度也可以用UV法进行鉴定：纯DNA的A260/A280>1.8，