实验7_植物总DNA的提取及琼脂糖凝胶电泳检测.doc

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1、.植物总DNA的提取及琼脂糖凝胶电泳检测（2010级生态班实验方案）一、实验目的1.理解用CTAB法提取植物组织DNA的原理。2.掌握CTAB法提取植物组织DNA的方法。3.了解真核基因组DNA的有关特性。二、实验原理由于植物细胞含有细胞壁及其细胞内高含量的多糖物质，因此一般的提取真核细胞基因组DNA的方法用在植物细胞上并不十分有效。十六烷基三乙基溴化铵（cetyltriethylammoniumbromide,CTAB）法是常用的提取植物细胞基因组DNA的方法。CTAB是一种去污剂，可溶解细胞

2、膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中（0.7mol/LNaCl）时，CTAB-核酸复合物是可溶的，当降低溶液盐浓度到一定程度（0.3mol/LNaCl）时，从溶液中沉淀，通过离心就可将CTAB-核酸复合物与蛋白质、多糖类物质分开。CTAB-核酸复合物再用70－75%酒精浸泡可洗脱掉CTAB。再经过氯仿/异戊醇(24:1)抽提去除蛋白质、多糖、色素等来纯化DNA，最后经异丙醇或乙醇等DNA沉淀剂将DNA沉淀分离出来。植物DNA的提取程序应包括以下几项：①必须破碎或消化细胞壁释放出细胞内容物；②必

3、须破坏细胞膜及核膜，使DNA释放到提取缓冲液中，常用CTAB一类的去污剂使细胞膜崩解；③DNA粗提物中往往含有大量RNA、蛋白质、多糖等杂质，可利用氯仿、RNase等除去。一旦DNA释放出来，其剪切破坏的程度必须要降到最低。CTAB法提取植物DNA，方法比较简单，适用于大多数植物。虽然得到的DNA纯度不是很高，但仍能满足限制性内切核酸酶分析或PCR扩增的要求。三、实验材料、试剂和仪器1.材料新鲜的植物组织（如幼叶、花器、幼根）或-80℃冻存的材料。仪器、用具:离心机、紫外分光光度计、微量移液器、

4、吸头、吸水纸、水浴锅、冰箱、研钵、液氮罐、pH计、高压灭菌锅、一次性手套、电泳仪、电泳槽等。2.试剂（1）2xCTAB缓冲液:CTAB(W/V)2%..Tris-HCIpH8.0100mmol/LEDTApH8.020mmol/LNaCl1.4mol/LPVP(聚乙烯吡咯烷酮)1%（1）TE缓冲液(pH8.0):称取1.211gTris、0.372gEDTA-Na2，先用800mL蒸馏水加热搅拌溶解，用盐酸调pH8.0，再用蒸馏水定容至1000mL。高压灭菌20min。（2）氯仿/异戊醇（24:

5、1,v/v）:将氯仿和异戊醇按体积24:1的比例混匀，置棕色瓶中，4℃保存。（3）β-巯基乙醇（4）70%乙醇（5）乙醇或异丙醇（6）5×TBE电泳缓冲液（1L）：Tris54gNa2EDTA·2H2O3.72g硼酸27.5g临用前稀释至0.5×TBE电泳缓冲液（7）6×上样缓冲液：0.25%溴酚兰、40%蔗糖四、实验步骤（一）植物DNA提取1．在5mL离心管中，加入1000μl的2×CTAB,65℃预热。用前加入20μlβ-巯基乙醇。2．取嫩的组织材料0.5-1g，放入经液氮预冷的研钵中，加入

6、液氮研磨至粉末状，用干净的灭菌不锈钢勺转移粉末到预热的离心管中，充分混匀后置65℃水浴中保温45-60min，并不时轻轻转动试管。3．加等体积的氯仿/异戊醇，轻轻地颠倒混匀，室温下10000rpm离心10min，移上清至另一5ml新管中。..4．吸上清到新管中（5mL离心管），用氯仿/异戊醇重复抽提一次。5．加入2倍体积的100%乙醇或0.7倍体积异丙醇，会出现絮状沉淀，-20℃放置30min或-80℃放置10min，12000rpm离心10-15min回收DNA沉淀。6．弃上清，用70%乙醇清

7、洗沉淀2次，吹干后溶于适量的灭菌ddH2O或TE缓冲液中。7．用紫外分光光度计在260nm、280nm波长分别读数。其中260nm读数用来估计样品中DNA的浓度，OD260/OD280的值用于估计DNA的纯度。1个OD260值相当于50μg/ml双链DNA。样品浓度(μg/ml)=OD260x稀释倍数x50对于DNA纯制品，其OD260/OD280≈1.8。OD260/OD280>1.8说明有RNA污染；OD260/OD280<1.8说明有蛋白质污染。注意，提取的DNA的质量由它的长度和纯度决定

8、。轻轻操作DNA溶液和快速冷冻植物组织对减轻机械剪切力和核酸酶切割非常重要，不能振荡，不能使用太细口的吸头，也不能吸得太快。多糖、蛋白质及木本植物中的酚类物质是植物DNA抽提中的主要污染物，提取材料要尽量使用幼嫩叶片。如果试材较老、多糖含量高，在提取缓冲液中应提高ß-巯基乙醇的用量，且在用氯仿/异戊醇抽提之前先用酚:氯仿:异戊醇抽提一遍，这样去除蛋白较为彻底。所得DNA应为无色或灰白色，若呈褐色则有多酚类物质污染；对多糖含量高的材料，提取液中CTAB的浓度可增至3%或更高。（二）琼脂糖电泳检测D