微团细胞培养步骤.doc

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1、雌雄鼠交配后第二天7:00观察阴栓，看到阴栓当日记为孕0d。孕12d脱颈处死，消毒后剖腹，取出子宫后将子宫在D-Hank’s液中涮洗至无血色（约3遍）后，分离出胚胎，要轻轻剥离，注意镊子不要夹到胚胎，倒D-Hank’s液在超净台中完成，倒前瓶子要在酒精灯上烧一下，盖瓶盖前也要将瓶盖和瓶口在酒精灯上烧一下。将胚胎在D-Hank’s液中涮洗至没有血液（约3遍），将胚胎转移至37℃的D-Hank’s液中，于解剖显微镜下分离前后肢芽或中脑等需要的组织，并将所需组织用吸管吸到另一个平皿中。全过程不是在超净台内，但要注意无菌操作，所用镊子注意在酒精灯上烧一下。如果在分离组织时，将分离下的组织

2、吹散或与其他无用的组织混合而不易分离，则弃之，一定不要吸上杂质，若平皿中组织碎块太多就换平皿。将放有组织的平皿移至超净台中，将组织吸入10ml试管/EP管中，用D-Hank’s液冲洗3遍，每次尽量将管中液体洗干净，但注意不要吸走组织。消化：加入0.5%胰蛋白酶，加上管盖，于37℃孵育10min。加入Ham’s-F12完全培养液终止消化，此时组织成粘稠的絮状，洗3次，要求同上，前2次无需定量，最后一次加需要的体积（如：1ml）。用200μl移液枪头反复吹吸黏稠的组织块，至组织块完全吹散，即成细胞悬液。用1ml针管（去针头）吸上全部细胞悬液，过200目细胞筛，用台盼蓝记数，细胞存活率

3、在90%以上（活细胞镜下透亮，不染色），调整悬液细胞浓度（肢芽细胞浓度为2×107/μl，中脑细胞5×l0/ml）于96孔板每孔正中加入10μl细胞悬液，放人培养箱中2-3h后给药。需要用通CO2的培养箱，放入前要用75%酒精消毒。加药时不同组用不同的试管/EP管配药，药在最初配制时须为终浓度的100倍，在加药前，用Ham’s-F12完全培养液将所需药配好，加药量为200μl/孔。放入培养箱中培养5d。5d后进行MTT染色，即每孔加入5mg/ml的MTT染料10μl，后放入培养箱中培养4h。吸去培养液，加入DMSO（二甲基亚砜）100μl，于570nm处测吸光值。加入Hank’s

4、-F12完全培养液(小牛血清:谷氨酰胺:青霉素:链霉素为88:10:l:1)终止消化