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时间:2020-02-01
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1、雌雄鼠交配后第二天7:00观察阴栓,看到阴栓当日记为孕0d。孕12d脱颈处死,消毒后剖腹,取出子宫后将子宫在D-Hank’s液中涮洗至无血色(约3遍)后,分离出胚胎,要轻轻剥离,注意镊子不要夹到胚胎,倒D-Hank’s液在超净台中完成,倒前瓶子要在酒精灯上烧一下,盖瓶盖前也要将瓶盖和瓶口在酒精灯上烧一下。将胚胎在D-Hank’s液中涮洗至没有血液(约3遍),将胚胎转移至37℃的D-Hank’s液中,于解剖显微镜下分离前后肢芽或中脑等需要的组织,并将所需组织用吸管吸到另一个平皿中。全过程不是在超净台内,但要注意无菌操作,所用镊子注意在酒精灯上烧一下。如果在分离组织时,将分离下的组织
2、吹散或与其他无用的组织混合而不易分离,则弃之,一定不要吸上杂质,若平皿中组织碎块太多就换平皿。将放有组织的平皿移至超净台中,将组织吸入10ml试管/EP管中,用D-Hank’s液冲洗3遍,每次尽量将管中液体洗干净,但注意不要吸走组织。消化:加入0.5%胰蛋白酶,加上管盖,于37℃孵育10min。加入Ham’s-F12完全培养液终止消化,此时组织成粘稠的絮状,洗3次,要求同上,前2次无需定量,最后一次加需要的体积(如:1ml)。用200μl移液枪头反复吹吸黏稠的组织块,至组织块完全吹散,即成细胞悬液。用1ml针管(去针头)吸上全部细胞悬液,过200目细胞筛,用台盼蓝记数,细胞存活率
3、在90%以上(活细胞镜下透亮,不染色),调整悬液细胞浓度(肢芽细胞浓度为2×107/μl,中脑细胞5×l0/ml)于96孔板每孔正中加入10μl细胞悬液,放人培养箱中2-3h后给药。需要用通CO2的培养箱,放入前要用75%酒精消毒。加药时不同组用不同的试管/EP管配药,药在最初配制时须为终浓度的100倍,在加药前,用Ham’s-F12完全培养液将所需药配好,加药量为200μl/孔。放入培养箱中培养5d。5d后进行MTT染色,即每孔加入5mg/ml的MTT染料10μl,后放入培养箱中培养4h。吸去培养液,加入DMSO(二甲基亚砜)100μl,于570nm处测吸光值。加入Hank’s
4、-F12完全培养液(小牛血清:谷氨酰胺:青霉素:链霉素为88:10:l:1)终止消化
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